植物抗菌肽研究进展.doc

四 川 师 范 学 院 学 报 ( 自 然 科 学 版 )Journal of Sichuan Teachers College (Natural Science)第 21 卷第 2 期2000 年 6 月J un1 2000Vol . 21No . 2文章编号 :100128220 (2000) 0220141205植物抗菌肽研究进展王琼 ,何清君( 四川师范学院生物多样性研究中心 ,四川 南充 637002)摘要 :植物抗菌肽是一类对细菌 、真菌等微生物有抑制或杀灭作用的小分子多肽 ,它能被细菌 、真菌或物理的 、化学的刺激所诱导 ,有些抗菌肽甚至在植物体内能组成性的表达 . 从化学结构来看 ,植物抗菌肽主要包括硫堇 、植 物防卫素 、脂转移蛋白和橡胶素类等 ,它们抗菌能力强 ,有较好的耐热性 ,抗菌机理独特 ,在农业 、医药及食品等领域有着广泛的应用前景. 作者总结了国内外植物抗菌肽研究进展 ,对其应用研究和基因工程等方面作了阐述 ,并对 进一步研究提出了一些展望 .关键词 :植物抗菌肽 ;硫堇 ;植物防卫素 ;脂转移蛋白 ;橡胶素中图分类号 :Q946. 1文献标识码 :A植物对微生物的防御一直 是 植 物 病 理 学 研 究 的 热 点 , 病 菌 危 害 是 世 界 范 围 内 农 作 物 减 产 的 重 要 原因1 3 . 植物的生长时时都可能遭受微生物的侵袭 ,目前研究表明 ,它虽然没有象哺乳动物那样特异的免疫 系统 ,但非特异的天然免疫体系却十分惊人 :不同类型的具抗菌作用的物质如过氧化氢酶 、裂解酶 、次生代谢物质以及抗菌蛋白 (如病原相关蛋白 ,PR 蛋白) 和抗菌肽 ( 本文将 100 个氨基酸以下的列为抗菌肽 ,100 个氨基酸以上的列为抗菌蛋白) 1 等在植物中广泛存在. 其中 ,对植物抗菌肽的研究近年来十分活跃 ,在许多研究 领域都显示出越来越重要的理论和运用价值 : (1) 植物抗菌肽的研究将更深入地推动人们对植物与病原微生物相互作用的分子生物学基础的认识 , (2) 植物抗菌肽基因可直接为作物抗病的分子育种提供目的基因 , (3)可更加详细地研究抗菌肽抑制或杀灭微生物的分子机制 ,为抗菌肽的人工设计获得更为广泛的数据 , (4) 植 物抗菌肽也可作为人类筛选抗菌药物的新资源. 尤其是近十年来 ,随着动物及微生物抗菌肽理论与应用研究的逐渐深入 ,先后有 Maganin7 ,Nisin8 和 Cecropins10 等抗菌肽在医药 、工业 、食品和农业中应用 ,抗菌肽独特 的性质展示出广阔的应用前景. 植物抗菌肽在分离纯化 、抗菌特性 、细胞毒性 、理化性质以及转基因等许多方面的研究进展也很快 ,发现了一大批理化性质和抗菌特性各异的植物抗菌肽 ,一些特异的植物抗菌肽基因已在烟草中成功表达. 本文综述了植物抗菌肽的研究成果 ,详细介绍植物抗菌肽的分类 、三维结构 、抗菌机理以 及抗菌肽基因工程等方面的研究进展与前景.1植物抗菌肽的种类1995 年 ,美国学者 A. G. Rao 在总结各种来源抗菌肽多种特性的基础上 ,提出可将抗菌肽分为 linear pep2tides (线形多肽) ,disulfide- linked peptides (二硫键铰链多肽) ,lantibiotics (细菌素) 和 designed synthetic peptides (合 成多肽) 等四类2 . 根据这一分类方法 ,迄今为止在植物中发现的抗菌肽几乎都属于 disulfied- linked peptides 类 ,即这些抗菌肽都有一个共同特征 :富含半胱氨酸 ( Cys) ,而且所有的半胱氨酸都形成分子内二硫键 . 根据二硫键的多少 、氨基酸的保守性以及高级结构的不同 ,植物抗菌肽又可分为以下几类 :收稿日期 :2000203215作者简介 :王琼 (1976 - ) ,女 ,四川夹江人 ,四川师范学院生物系在读硕士生 ,主要从事生物多样性研究.1 . 1硫堇 ( Thionins)硫堇是一类首先在禾本科植物种子中发现的分子量为 5 KD 左右的碱性蛋白 ,氨基酸残基数约为 4547 ,根据含有 Cys 的多少可分为两类 ,一类含 8 个 Cys ,而另一类只含 6 个 ,如在 radish 贮藏器官及 Abyssinian cabbage 种子中得到的硫堇都含 6 个 Cys ,而禾本科植物的种子 、叶的硫堇蛋白都含有 8 个 Cys. 在所有的硫堇 蛋白中具保守的氨基酸残基序列是 3 ,4 ,16 ,27 ,33 和 41 位的 Cys ,10 位的 Arg 以及 13 位的芳香族氨基酸残 基 . 三维结构研究表明无论是含 8 个 Cys 的或 6 个 Cys 的硫堇都具有相似的“L”型结构 ,其长臂由两条反平行 的- 螺旋构成 , 短臂由两条反平行的- 链构成的- 折叠形成. 从小麦种子得到的两种含 8 个 Cys 的硫堇 1-purothionin和-purothionin 都包含一个磷脂结合的位点 ,这可能是它们对动物及植物细胞产生毒性的原因所在1 .硫堇广泛分布于单子叶植物和双子叶植物 ,在植物体的根 、种子及叶也得到了多种硫堇蛋白1 . 50 多年 前 ,人们知道硫堇在体外能抑制细菌及真菌的生长. 近年来研究表明 ,硫堇能抑制许多病原细菌 (包括革兰氏 阳性和阴性菌) 和真菌的生长 ,其抗菌机制可能是造成物质的泄漏20 ,5mMCa2 + 离子就能抑制硫堇的抗菌活 性 ,而对其它离子如 Ba2 + 、K+ 、Mg2 + 等相对不敏感 .1 . 2植物防卫素 ( Plant defensins)植物防卫素因与动物防御素同源而得名 ,分子量与硫堇相当 ,一般有 4554 个氨基酸残基 ,含 8 个 Cys ,正因如此 ,人们曾将分离到的第一个防卫素叫作- thionins ,直到与硫堇蛋白完全不同的高级结构的阐明才将 它们区别开来 . 典型的植物防卫素包含一条三链的反平行的- 折叠和一段- 螺旋. 其中 , - 螺旋中的 CXXXC( C 代表 Cys ,X 代表任意氨基酸 ,下同) 片段的半胱氨酸残基都通过二硫键与 C- 末端的- 链中的 CXC 片段的半胱氨酸残基相连 ,这种由半胱氨酸残基稳定的- 螺旋结构也见于昆虫防卫素中10 . 一系列植物防卫素氨 基酸序列的比较研究表明 ,8 个 Cys ,13 ,34 的 Gly 以及 11 位的芳香氨基酸和 29 位的 Glu 都是严格保守的.植物防卫素能抑制多种真菌的生长 ,大量研究表明它能导致真菌显著而持续的钙离子流入和钾离子渗 出 ,培养基中离子浓度的增加会降低防卫素的抗真菌能力 ,但植物防卫素在体外抑制真菌的精确机制目前还 不十分清楚1 ,33 .植物防卫素广泛分布于种子植物 ,在植物的各种器官 (叶 、块茎 、花 、种子和某些夹果等) 中都发现过防卫 素 . 对 Arabidopsis 的研究表明 , 植物防卫素基因是严格的器官特异性表达. 目前所知 , 至少有四种防卫素 ( 即 pea , hacco , arabidopsis , radish ) 是 被 真 菌 感 染 后 诱 导 的 , 因 此 防 卫 素 在 植 物 的 防 御 反 应 中 起 着 重 要 作用35 ,37 38,可能是抵御或杀灭外来微生物的重要成分 ,但没有直接证据1 .1 . 3脂转移蛋白 (Lipid transfer proteins ,LTPs)LTPs 是约 9093 个氨基酸残基的含 8 个 Cys 的同源肽家族 ,由于在体外它能将磷脂从表面转运到线粒 体内而得名. 但从橡胶种子中得到的 LTPs 却不具转脂活性 ,而有很强的抗菌活性 ,特别是近几年的研究表 明 ,LTPs 大多具有抗菌活性 ,不仅能抑制许多革兰氏阴性菌 ,还能抑制革兰氏阳性菌和多种真菌的生长 ,是 一类特殊的抗菌肽家族36 .大量 LTPs 家族的氨基酸序列比较表明 ,高达 30 %的氨基酸序列在所有转脂蛋白中明显保守 ,包括 8 个Cys 、以及 12 个疏水氨基酸和芳香氨基酸的位置. 通过核磁共振 (NMR) 对其立体结构的研究 ,LTPs 都具有由4 个柔性环连接而成的由- 螺旋构成的相似的折叠模式.有关 LTPs 抗菌机制的研究目前已积累了许多事实 ,有的学者认为转脂蛋白的真正功能在于通过协助转 运亲脂物质而保护损伤细胞免受微生物的侵害1 . 据报道 ,在植物的许多器官 ( 胚 、子叶 、茎 、叶 、十字花科的 果实以及花器官) 都存在着 LTPs ,而且发现在围绕植物器官的皮细胞和外周细胞 、器官脱离区的表达特别高 . 免疫细胞化学定位研究揭示 LTP 可能存在于细胞壁 ,如 arabiodopsis 和 broccoli 叶中的 LTPs. 更有趣的是 ,可用缓冲液通过简单的浸渗作用直接将大量的 LTPs 从大麦叶片中洗脱下来 , 从而表明了 LTPs 的特殊性质1.第 21 卷第 2 期王琼等 :植物抗菌肽研究进展1431 . 4 hevein 类和 knottin 类抗菌肽这是一类含几丁质结合结构域的植物抗菌蛋白. Hevein (橡胶素) 是橡胶乳液中的一种主要蛋白 ,含 43 个 氨基酸残基 ,其中 8 个是 Cys ,能抑制多种真菌的生长 ,即使用去几丁质酶的橡胶素制剂也是如此 ,与 hevein同源的抗菌肽家族还能抑制多种革兰氏阳性细菌的生长. NMR 分析显示 ,hevein 类抗菌肽是由一条 3 链的-折叠和一段连接着第二 、第三段链的- 螺旋构成.Knottin 类抗菌肽含 6 个 Cys ,三维结构与 hevein 有相似之处 ,包括一条 3 链的- 折叠和一个连接着第一 、 第二段链的长环.RNA 杂交分析表明 amaranth 和 mirabilis jalapa 两种植物的 hevein 类和 knottin 类肽的表达仅限于种子 ,而 橡胶素基因可在叶与茎中表达. 可见 ,有关基因表达调控的研究还不够深入 .1 . 5 含 4 个 Cys 的抗菌肽Duvick 等 (1992) 从玉米种子中分离出 一 种 抗 菌 肽 MBP- 1 , 含 33 个 氨 基 酸 残 基 、4 个 Cys , 分 布 在 两 个CXXC 片段之中 ,MBP- 1 能抑制大多真菌以及至少一种革兰氏阳性菌 ( Clavibacter michiganense ) 和一种革兰氏 阴性菌 ( E. coli ) 的生长. Tailor 等 (1997) 在 impatiens balsamina 种子中发现一种抗菌肽 lb- AMPs ,它与目前所报 道的抗菌肽序列完全不同 ,仅有 20 个氨基酸残基 (4 个 Cys ,基序为 CC 或 CXXXC) ,是迄今为止在植物中发现 的最短抗菌肽 ,能抑制多种真菌和革兰氏阳性菌的生长 ,而对革兰氏阴性菌和培养的人细胞没有影响. lb- AMPs 的转录和调控方式也很特别1 ,18 .2抗菌肽基因工程植物生物技术研究的一个重要目标就是以增加农作物的抗性来提高产量 ,抗病育种在世界范围内显得尤为重要2 3 ,22 ,34 . 有关植物与微生物相互作用的分子生物学的研究表明 ,作为小分子的抗菌肽基因转入植 物将大大提高农作物的抗病性22 24 ,31 ,而且 ,来源于植物的抗菌肽基因更易在植物中表达和调控. 因此 ,植物抗菌肽转基因研究正成为热门话题 . Carmona 等人将大麦硫堇基因转入烟草 ,获得了高抗病烟草 ,检测到的硫堇表达量达每克鲜叶含 20ug ,对两种植物病原菌 Pseudomonas Syringae pv . Tabaci 和 Pseudomonas Syringae pv . Syringae 产生明显抗性17 . Terras 等将 radish 防卫素 Rs- AFP2cDNA 转入烟草 ,其表达可达叶片总蛋白的0 . 2 % ,并对小叶病源真菌 Alternaria lorgipes 的抗病性增强七倍16 . 总的来说 ,植物抗菌肽转基因研究的工作做得还不多 ,也有与此不符的报道 ,许多问题还有待于进一步探索 ,国内在这一领域的研究应迎头赶上.3问题与展望继 1965 年从蜜蜂毒液中分离出第一个抗菌肽 Melittin 以来19 ,抗菌肽的研究丰富了人们对高等生物免疫防御机制的认识26 ,32 . 与动物抗菌肽研究相比 ,植物抗菌肽在研究的种类及其抗菌机理上大有研究潜能.到目前为止发现的所有植物抗菌肽几乎富含 Cys (我国学者胡忠在商陆根中分离出一种不含 Cys 的抗菌小蛋白14) 的阳离子多肽 ,不仅会问 :植物中究竟有没有与动物同源的线形- 螺旋抗菌肽 ? 植物中究竟有没有有别于其它物种的新的抗菌肽类型 ? 生物的进化是极其复杂的 ,随着研究的深入 ,一定会有新的发现.另一方面 ,植物抗菌肽虽然在体外具有抗菌活性 ,但在体内 ,它对植物防御反应的贡献究竟如何 ? 人们 还不甚了之. 我们现在还没有像 thionins 、plant defensins 和 LTPs 在植物体内作为防卫物质的直接证据1 .本世纪 20 年代以来发现的抗生素 ,对人类的健康做出巨大的贡献 ,但随着抗生素的大量使用 ,微生物耐药性增强的问题日渐突出 ,寻找新的抗菌资源已成为备受关注的焦点15 ,24 25 . 抗菌肽抗菌机制独特 ,不易使 微生物产生耐药性 ,能直接杀灭多种微生物 ( 甚至病毒 、肿瘤和 AIDS 病毒) ,是一类大有开发前景的抗菌药 物1 ,2 ,6 8 ,10 ,21 ,25 . 十多年前 ,来自微生物的抗菌肽 (Nisin) 和两栖动物的抗菌肽 (Maganins) 先后应用于医药 、食品和农业等方面 ,Maganins 已用于某些疾病的临床治疗 ,Nisin 已被美国 FDA 批准为血液防腐添加成分. 随着对分离纯化 、抗菌特性 、表达调控及毒力学性质等问题的进一步研究 ,植物抗菌肽在不久的将来大大造福于人类.参考文献1Willem F B , Cammue B P A ,De Bolle M F C ,et al . 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