P27、PCNA与IgA肾病中医证型及病理类型的关系.doc

福建中医学院2002届硕士研究生学位论文 中医内科学专业 王伟The Relationship among P27, PCNA, Pathological Classification and Zheng differentiation-classification of IgA nephropathyMajor: Internal medicine of TCMPostgraduate: Wang WeiTutor: Prof. Ruan ShiweiABSTRACTObjective: To observe the expression of P27 and PCNA form paraffin-embedded renal tissue sections of patients with IgA nephropathy and explore the relationship among P27, PCNA, pathological classification and Zheng differentiation-classification of IgA nephropathy.Methods: Apply renal biopsy to 48 cases of primary IgA nephropathy and the specimen of renal had been examined with routine pathological method and immunohistochemistry. All the patients with IgA nephropathy in the study were classified into three groups based on Zheng differentiation-classification, such as liver kidney yin insufficiency, qi-yin asthenia and dampness-heart (TCM). The histological grade was divided into four grades.Results: 1.The number of PCNA+ correlated with histological grade (rs= 0.336, P0.05). A negative correlation was also found between P27+ and histological grade (rs= -0.563, P0.01). 2. The histological grade of qi-yin asthenia is higher than that of dampness-heart (TCM) and the liver kidney yin insufficiency. There was no difference between dampness-heart (TCM) and the liver kidney yin insufficiency in statistic. 3. （1） The level of P27 in dampness-heart (TCM) was significant higher than that in qi-yin asthenia. （2） The level of PCNA in qi-yin asthenia was significant higher than that in dampness-heart (TCM). （3） The level of P27 in the liver kidney yin insufficiency was higher than that in qi-yin asthenia. （4） The level of PCNA in liver kidney yin insufficiency was higher than that in dampness-heart (TCM). In a word, the level of P27 in different Zheng differentiation-classification decreased according to the following sequence: dampness-heart (TCM), t liver kidney yin insufficiency, qi-yin asthenia. On the contrary, the level of PCNA increased in the same sequence.Conclusion: 1. P27 and PCNA could be useful in grading renal damage histologically and predicating progress of IgA nephropathy.2. The histological grade of different Zheng differentiation-classification was significant different. The histological grade of qi-yin asthenia is higher than that of dampness-heart (TCM) and liver kidney yin insufficiency. There was no difference between dampness-heart (TCM) and liver kidney yin insufficiency in statistic. 3. Different expression of P27 and PCNA could indicate the progress of Zheng differentiation-classification in IgA nephropathy.MeSH Term: glomerulonephritis,IgA/diagcell cycle proteins/bloodproliferating cell nuclear antigen/bloodZheng differentiation-classificationqi-yin asthenia/diagdampness-heart (TCM)/diagliver kidney yin insufficiency/diagP27、PCNA与IgA肾病中医证型及病理类型的关系 专 业:中医内科学研究生:王伟导 师:阮诗玮 教授、主任医师摘 要ABSTRACT目的：运用免疫组化方法研究原发性IgA肾病患者肾组织中P27、PCNA的表达，探讨两者与IgA肾病病理分级及其中医证型之间的关系。方法：选择行肾穿刺活检的IgA肾病住院患者52例，并按照中医辨证分型标准将其分为肺肾气虚证、脾肾阳虚证、肝肾阴虚证、气阴两虚证、血瘀证、湿热证六型。系膜增生的病理组织学分为4级。运用免疫组化方法检测P27、PCNA的表达。结果：1、IgA肾病各个病理分级P27、PCNA的表达两两比较有非常显著性差异或显著性差异。显示随着系膜细胞增生的病理分级程度增高，PCNA的表达增高，而P27的表达则按相反方向进行。病理分级和P27、PCNA表达的等级相关性检验（Spearman法）显示：P27的表达与病理类型呈非常显著负相关，而PCNA的表达与病理类型呈显著正相关。2、IgA肾病三个中医证型的病理分级之间差异非常显著,其中气阴两虚证的病理分级比湿热证、肝肾阴虚证高，湿热证与肝肾阴虚证的病理分级之间无显著性差异。3、随着湿热肝肾阴虚气阴两虚的进展，P27的表达呈现出逐渐减少的趋势，而PCNA的表达呈现出逐渐增加的趋势。结论：1、P27、PCNA作为判断IgA肾病肾脏组织学损伤程度和预后的指标值得深入研究。2、IgA肾病中医证型之间病理分级差异显著。气阴两虚证病理分级比湿热证和肝肾阴虚证为高，而湿热证和肝肾阴虚证的病理分级无显著性差异。3、P27与PCNA的不同表达可以反映IgA肾病中医证型的演进。主题词：肾小球肾炎，IgA/诊断 细胞周期蛋白质类/血液 增殖细胞核抗原/血液 辨证分型 气阴两虚/诊断 湿热（中医）/诊断 肝肾阴虚/诊断P27、PCNA与IgA肾病中医证型及病理类型的关系 本课题系福建省卫生厅资助项目专 业: 中医内科学研究生: 王伟导 师: 阮诗玮 教授、主任医师前 言INTRODUCTIONIgA肾病是影响我国青少年身体健康的常见肾脏疾病，占肾活检确诊的原发性肾小球肾炎的3040。本病首先由Berger在1968年报告，发病机制尚未完全清楚，其肾活检免疫病理特点为免疫球蛋白IgA在肾小球系膜区的颗粒样沉积。患者以青少年居多，临床表现主要有发作性肉眼血尿、镜下血尿伴或不伴蛋白尿。既往认为IgA肾病预后良好，但是，近20年来随着研究的深入，对该病的认识有了深刻的变化，发现经过不同时期的进展，许多患者可能发生肾功能不全。它的一个重要特征是血肌酐上升到一定程度时，其病情可在短时间内进展为终末期肾衰，此时各种干预措施都不能逆转这种进程。IgA肾病出现严重蛋白尿、高血压、肾小球硬化、肾间质纤维化和肾小管萎缩都是预后不良的重要因素。在我国，IgA肾病已成为终末期肾病的最常见的病因之一，给国家和患者个人及其家庭造成了沉重的经济和社会负担。所以早期发现、早期诊断、及早进行干预治疗显得尤为重要。近年来，在分子水平使用免疫组化方法研究肾脏疾病日益受到重视。但从中医理论出发，研究细胞周期调控蛋白P27和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）与IgA肾病中医证型关系的论文尚未见诸于各大学术刊物。本课题研究旨在通过检测P27、PCNA在IgA肾病不同中医证型及病理类型中的数值，通过统计学分析，探讨PCNA、P27与IgA肾病的中医证型及病理类型关系，以期从一个新的角度进一步了解IgA肾病的细胞机制，找出IgA肾病中医证型动态性变化的病理基础，并在分子生物学水平对其形成机制进行研究。资料与方法METERIALS AND METHODS一、 中医证型及病理分型标准：（一）中医辨证分型标准中医辨证分型的依据是1993年中医新药临床研究指导原则中的中医新药治疗慢性肾炎的临床指导原则（其制定参照了1986年第二届全国中医肾病专题学术讨论会通过的慢性原发性肾小球疾病中医辨证分型试行方案）。下列6个证型中，凡具备其中任何3项者，即可诊断为该证。1、肺肾气虚证：面浮肢肿,面色萎黄；少气无力；易感冒；腰脊酸痛；舌淡、苔白润，有齿印，脉细弱。2、脾肾阳虚证：浮肿明显,面白；畏寒肢冷；腰脊酸痛或胫酸腿软,足跟痛；神疲,纳呆或便溏；性功能失常(遗精、阳萎、早泄）或月经失调；舌嫩淡胖，有齿痕，脉沉细或沉迟无力。3、肝肾阴虚证：目睛干涩或视物模糊；头晕、耳鸣；五心烦热,口干咽燥；腰脊酸痛,梦遗和月经失调；舌红少苔,脉弦细或细数。4、气阴两虚证：面色无华；少气乏力,易感冒；午后低热或手足心热；口干咽燥或长期咽痛,咽部暗红；舌质偏红,少苔,脉细或弱。5、湿热证：皮肤疖肿,疮疡等；咽喉肿痛；脘闷纳呆,口干不思饮；小便黄赤,灼热或涩痛不利；舌苔黄腻,脉濡数或滑数。6、血瘀证：面色黧黑或晦暗；腰痛固定或刺痛；肌肤甲错或肢体麻木；舌色紫暗或有瘀点、瘀斑；脉象细涩；尿纤维蛋白降解产物(FDP)含量升高；血液流变学检测显示全血粘度、血浆粘度升高。（二）病理分型标准肾小球系膜增生的病理组织学分级有4级1：级：肾小球形态基本正常，仅见轻度系膜基质增多或伴有局灶性系膜细胞轻度增生。级：局灶节段性系膜细胞中度增生或伴弥漫性系膜细胞轻度增生。级：弥漫性系膜细胞中度增生伴个别肾小球新月体形成。级：弥漫性系膜细胞重度增生伴较多肾小球新月体形成。二、 研究对象1、 病例来源所有病例均来自于2000年9月2002年3月期间在福建省人民医院肾内科住院行肾组织活检并曾进行P27、PCNA免疫组化检查的病人。（1） 病例纳入原则本病诊断依靠肾活检标本的免疫病理学检查，即肾小球系膜区或伴毛细血管壁IgA为主的免疫球蛋白呈颗粒样沉积2。（2） 病例排除原则1） 不符合纳入原则，资料不全影响判断者。2） 本课题研究范围仅限于原发性IgA肾病，要排除以下继发性系膜IgA沉积的情况：多系统疾病：过敏性紫癜、强直性脊柱炎、干燥综合征等；肿瘤性疾病：肺癌、鼻咽癌等；感染性疾病：麻风、弓形体病；其它：慢性肝病、慢性阻塞性支气管炎等肺部疾病等。（3）病例基本情况根据以上原则所得的病例构成如下：共收集病例52例。由于血瘀证、肺肾气虚证、脾肾阳虚证以及属于病理型的病例太少，无统计学意义，故此予以剔除。实际得到的符合标准可以进行统计学处理的病例为48例。其中男25例，女23例，平均年龄42.7017.02岁(16-49岁)。病程6.513.84年(1-10年)。在48个病例中，湿热证17例，肝肾阴虚证12例，气阴两虚证19例。在48个病例中，病理分级级、级、级的例数分别为19、13、16例。三、 客观指标的检测患者肾活检标本分别行常规病理检查及P27、PCNA免疫组化检查。常规病理检查在中国人民解放军南京军区福州总医院病理科进行。P27、PCNA免疫组化检查在福建省人民医院病理科进行。P27、PCNA免疫组化检查方法：试剂为鼠抗PCNA(增殖细胞核抗原)、P27单克隆抗体(PCNA试剂盒、P27试剂盒、SP试剂盒、DBA试剂盒均由MAXIM公司生产)。将3m石蜡包埋组织切片经高温高压抗原修复(PCNA组织切片不经高温高压抗原修复)。修复后的切片，经SP免疫酶标法染色(按SP试剂盒操作步骤进行)：(1)石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次。每次3min (33)。(2)每张切片加一滴过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育10min。PBS冲洗33。(3)每张切片加一滴非免疫性动物血清(试剂B)、室温下孵育5min，PBS冲洗1次。(4)每张切片加一滴PCNA或P27抗体，室温下孵育60min。PBS冲洗33。(5)每张切片加一滴生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10min。PBS冲洗33。(6)每张切片加一滴链亲和素过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10min。PBS冲洗33。(7)每张切片加一滴新鲜配制DBA溶液。显微镜下观察310min。(8)自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。用直接计数法计数阳性细胞，在高倍镜下(400倍)、以电脑图形分析仪分别计数肾小球内棕色颗粒及细胞总数，求出每个肾小球阳性细胞数的比值，并计算均值。四、 统计方法：所有计量数据以均数标准差（s）表示。采用F检验、q检验及等级相关分析。P27、PCNA与病理分级行等级相关分析。中医证型与病理分级行Ridit检验，部分数据计算采用SPSS软件进行。结 果RESULTS一、IgA肾病病理分级与P27、PCNA的关系，见表1表1 IgA肾病病理分级与P27、PCNA的关系病理分级nP27PCNA190.7680.0810.2280.079130.540.188#0.570.128*160.3620.2130.6190.181注：三个病理类型的P27比较F=21.064，P0.01。三个病理类型的PCNA比较F=27.695, P0.01。进一步行q检验结果如下：级与级比，P0.01; 级与级比，P0.01；级与级比，# P0.01，* P0.05。各组间P27、PCNA均值两两比较有非常显著性差异或显著性差异。显示随着系膜细胞增生的病理分级程度增高，PCNA表达增高，而P27表达则相反进行病理分级和P27、PCNA的等级相关性检验（Spearman法）显示：对于P27，rs=-0.563(P0.01)，呈非常显著负相关；对于PCNA，rs= 0.336(P0.05)，呈显著正相关。二、IgA肾病病理分级与中医证型的关系，见表2表2 IgA肾病病理分级与中医证型的关系中医证型合计湿 热102517肝肾阴虚37212气阴两虚64919注：Ridit检验结果显示，湿热型比肝肾阴虚型 P0.05， 湿热型比气阴两虚型 P0.01，肝肾阴虚型比气阴两虚型 P0.01，三型总比较 P0.01。显示气阴两虚型病理分级比湿热型、肝肾阴虚型高，湿热型与肝肾阴虚型病理分级无显著性差异。三型之间病理分级差异非常显著。三、 中医证型与P27、PCNA的关系，见表3表3 IgA肾病中医证型与P27、PCNA的关系中医证型nP27PCNA湿 热170.6990.4240.2720.133肝肾阴虚120.6420.339*0.3440.137*气阴两虚190.5160.2240.4340.304注:三个中医证型的P27比较 F=23.675，P0.01。三个中医证型的PCNA比较 F=25.353，P0.01。进一步行q检验结果如下：湿热型与肝肾阴虚型比，P0.05，湿热型与气阴两虚型比，P0.01;肝肾阴虚型与气阴两虚型比，*P0.01。结果显示湿热型与肝肾阴虚型与P27、PCNA值有显著差异，而湿热型与气阴两虚型、肝肾阴虚型与气阴两虚型的P27、PCNA值有非常显著差异。可见随着湿热肝肾阴虚气阴两虚的进展，P27的表达呈现出逐渐减少的趋势，而PCNA的表达呈现出逐渐增加的趋势。讨 论DISCUSSION一、 P27、PCNA在增殖性肾炎研究中的应用（一）关于细胞周期和细胞周期调控蛋白高等生命体的主要特征是细胞通过分裂来增殖、分化，是个体发育、成熟并繁衍后代。在细胞分裂之前，母代细胞的遗传物质（DNA）及其它重要的分子物质必须通过倍增过程，这个过程是通过细胞周期来完成的。细胞顺序完成一个细胞周期就完成一次增殖。不同生命体的细胞及同一系列中的不同细胞的细胞周期不同，一般是S+G2+M的时间变化小，而G1期时间变化较大。G1期长短不一决定了各个细胞群体的细胞周期时间不同，此期发生的生化事件是与细胞启动DNA合成（进入S期）有关，主要进行一些DNA复制必需的RNA和蛋白质的合成。如果主要的蛋白和/或RNA合成被破坏、抑制，细胞就进入不了S期。已经发现过在G1期的后期存在一个限制点（Restriction point，R点），只要G1期内的正性调控蛋白合成积累到一定的程度，周期越过R点，这之后细胞就不再依靠细胞外生长因子的存在与否而顺延完成整个周期，可见G1期是细胞周期关键的限速阶段。S期主要的生化事件是染色体DNA分子的半保留自我复制。G2期是为细胞进入M期而进行多种细胞的结构和功能之准备。M期是通过胞核分裂和胞质分裂把两组染色体完全分到两个子核中并生成两个完整的子细胞。所有这些过程都是在细胞周期调控蛋白的控制下完成的。G1期是细胞周期的起始阶段，控制细胞的生长、决定细胞命运的阶段。在胞外信号的作用下，细胞或是顺次完成生长周期而增殖；或是从G1期脱离细胞周期，其中暂时的可逆地离开静息期（G0），不可逆的离开可能是终末分化或死亡。1953年Howard等人首先提出了细胞分化是通过细胞周期来完成的理论。随后的几十年研究取得了许多进展，均表明哺乳动物的生长周期调控是由一系列苏/丝氨酸蛋白激酶来实现的。这类酶由两个亚基构成：细胞周期素（Cyclin）是调节亚基,细胞周期素依赖的蛋白激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）是水解亚基，两者必须装配在一起形成全酶才有活性。到目前为止，在哺乳动物细胞中已发现的Cyclin有八种，即Cyclin A、B、C、D、E、F、G、H，CDKs有七种，即CDK1、2、3、4、5、6、7，这些都是对细胞周期进展起促进作用，称为正调节因子。同时还发现了一些抑癌基因编码的小分子蛋白，对细胞周期进展起负调节作用，包括P15、P16、P21、P18、P19、P27、P57等。正常肾脏细胞多数为末端分化细胞，在完成其生理生化功能后即被清除，但仍存在少量静息（G0）细胞。在免疫反映介导的肾小球炎症发病时，肾固有细胞及浸润的炎症细胞释放多种炎症介质，并持续刺激肾小球固有细胞，引发其不断进入细胞周期，细胞过度增殖；同时增生的固有细胞产生的炎症介质增加，如此循环往复是导致肾小球肾炎活动和肾小球进行性硬化的病理基础。DNA合成细胞分裂染色体复制G2染色体分裂细胞周期示意图有丝分裂 MG1SCDKcyclin系膜细胞增殖是肾小球肾炎主要的病理表现，故对它的研究是肾小球肾炎研究的重要内容。Shankland比较观察了正常大鼠肾小球细胞和抗Thy-1抗体诱发的系膜增殖性肾炎时肾小球系膜细胞G1期的Cyclins和CDK抑制因子的变化，发现前者改变和细胞增殖正相关，这是首次对在体肾小球固有细胞的生长周期调节进行研究的报道。（二）P27在肾脏病研究中的应用P27是1994年由Polyak等和Toyoshima等发现的一种细胞周期调控蛋白,它是广谱的细胞周期素（cyclin）细胞周期激酶（cell cycle dependent kinase, CDK）复合物抑制物，能广泛地抑制G1期、S期的cyclin与CDK结合，使视网膜瘤蛋白不能磷酸化，从而不能释放转录因子E2F，使G1期过度延长,细胞增殖受到抑制。目前推测它是细胞周期G1/S期转换过程的关键。在正常的情况下，P27在G0/G1期表达增高，当细胞进入S期则表达下降。P27使维持细胞静止状态所必需的。P27水平不受转录控制，而是由蛋白翻译（蛋白合成）和降解（蛋白分解）来调控，其mRNA水平在整个细胞周期内无变化。已知肾小球系膜细胞参与了多种肾小球疾病的发生与发展，如狼疮性肾炎、IgA肾病等。肾小球系膜细胞在肾脏疾病中对损伤的反映表达为细胞增殖和细胞外基质的增多，而增殖的细胞又可以产生多种炎症因子，刺激细胞重新进入细胞周期而不断增殖，进一步加重肾小球炎症和硬化过程。因此，无论损伤机制如何，肾小球系膜细胞增殖的失衡在肾小球损伤和肾小球硬化发病机制中起着早期而关键的作用。设法调控肾小球系膜细胞增殖，对于争取肾小球损伤的逆转和防止肾小球疾病慢性演变具有重要意义。目前，P27对肾小球系膜细胞增殖的调节作用越来越引起学者们的重视。Shankland等研究发现静止的大鼠离体的肾小球系膜细胞有P27表达。血小板源性生长因子（PDGF）和碱性纤维母细胞生长因子（b-FGF）诱导系膜细胞增生时，P27蛋白表达量明显下降，显示生长因子诱导系膜细胞增殖与P27表达水平下降相关联。同样，在体内正常大鼠的肾小球有较高内源性P27的表达。在肾小球系膜增殖性肾小球肾炎的Thy-1模型中，系膜细胞增殖开始即出现P27蛋白水平的明显下降，同时与CDK2活性的增高水平一致。在系膜细胞增殖高峰时几乎检测不到P27，而当细胞增殖消退时，P27又恢复到基础水平3。既往研究提示，P27是介导肾小球系膜细胞对损伤产生增殖反应的一个主要因素。近期，Ophascharoensuk等同时在P27/和P27/小鼠建立肾小球肾炎模型，结果发现：1、在正常生理条件下青春期的P27/小鼠的肾脏并不因P27自身的缺失而出现进行性DNA合成。2、为保证P27/小鼠和P27/小鼠存在相同的免疫反应，将P27/小鼠的骨髓移植给P27/小鼠，结果肾小球增殖在骨髓移植的P27/小鼠建立的肾小球肾炎模型明显高于P27/小鼠。这也提示肾小球P27表达的水平比免疫反应更能决定肾小球对损伤的增殖反应。由上可知，系膜细胞的增殖虽然需要细胞周期正性调节蛋白如cyclinA-CDK2的表达，但P27对系膜细胞增殖的启动和放大起决定作用。P27显微镜下图像总之，P27是一个内源性的抑制或终止残余细胞对病理性生长刺激的增殖反应的调控因子。细胞周期抑制蛋白的发现和研究可以使我们在一个新的水平进一步了解各种肾脏疾病的细胞细胞机制，为早日寻找有效的治疗方法，防治和延迟肾小球硬化提供理论依据。（三）PCNA在肾脏病研究中的应用增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）又称Cyclin或DNA聚合酶辅助蛋白，是一个36KD的核内蛋白多肽4、5。1978年Myachi等首次发现系统性红斑狼疮患者血清中的自身抗体（抗核抗体）与细胞核增殖状态有密切关系。以后的研究发现PCNA还参与了Simian virus40的体外复制,并且证实PCNA与Cyclin和DNA聚合酶扶助蛋白为同一物质。PCNA显微镜下图像PCNA在细胞增殖周期中的作用在于：与DNA聚合酶结合，从而引导完成DNA的复制。当PCNA缺乏时,在DNA的后随链（lagging-strand）的模板上只有短的DNA片段合成；当PCNA与DNA聚合酶结合时，前导链被合成（leading-strand）被合成，从而使得DNA双链能够协调的合成出来。因而DNA聚合酶和PCNA可能负责合成前导链6。当PCNA的反义寡脱核苷酸（Anti-sense Oligo deoxynucleotides）作用于细胞时，DNA的合成和细胞的有丝分裂完全被抑制7。从而进一步证实了PCNA在细胞DNA合成和细胞周期进展方面的重要作用。PCNA的表达在细胞增殖周期中的不同阶段是不同的。在静止期和G1早期，PCNA几乎不表达；G1晚期PCNA的表达开始增加；在S期达到高峰，随后在G2期和M期降低8、9、10。PCNA的发现和其单克隆抗体的建立为研究正常和异常细胞在体内的增殖变化提供了新的研究手段。由于PCNA的表达与DNA的合成有直接的关系，它的存在直接表明细胞处于增殖周期，从而有助于准确了解各种肾脏病的发病过程和进展情况。由于PCNA处在细胞核内，它的免疫组化染色可以与细胞的其它标记物（识别胞浆或胞浆性抗原）的染色接合起来，利用双标记技术可以准确判别处于增殖周期的细胞即PCNA阳性细胞属于那种细胞类型，从而有助于分析各种细胞在肾脏病进展中的作用。目前，许多作者应用PCNA染色观察各种肾脏病模型的细胞增殖状态。二、肾炎中医证型与病理类型之间关系的研究现状慢性肾小球肾炎的中医证型一般分为肺肾气虚型、脾肾阳虚型、肝肾阴虚型、气阴两虚型、湿热型、瘀血型六个证型。临床工作中发现往往在一个中医证型中，其肾脏病理分级有轻有重，而同一病理类型又可表现多种中医证候。陈洪宇，王永均11等认为某一病理类型在不同的发展阶段其中医证候，包括本证和标证，往往是动态的。金世建，熊曼琪等12认为系膜增殖性肾炎为本虚标实，其中本虚以阴虚为主，后期转为气阴两虚。为了说明中医证型按什么规律变化以及什么原因影响中医证型的变化，曾有学者13、14、15探讨了尿表皮生长因子（尿EFG），血、尿内皮素，一氧化氮与中医证型的关系，但都不能全面确切地从物质基础上说明中医证型的转变的内在客观规律。然而，在临床上确实存在这样的事实：肝肾阴虚患者，临床症状较气阴两虚者轻，且预后较好。而肺肾气虚型，脾肾阳虚型患者往往病情严重，病理分级也高，而且同一病理类型中可有肝肾阴虚，也可有气阴两虚。刘宏伟，时振声16也等认为肾小球病变多遵循阴虚气阴两虚阳虚阴阳两虚的发展过程。因此在分子生物学领域，开展对肾小球系膜增生机制的免疫组化研究，探讨中医证型的动态性具有重要的理论与实际意义。通过PCNA、P27与IgA肾病的中医证型及病理类型关系的研究可以使我们在一个新的水平进一步了解IgA肾病的细胞机制，及它们与中医证型的关系，找出IgA肾病中医证型动态性变化的病理基础，并在分子生物学水平对其形成机制进行研究。三、 P27、PCNA与IgA肾病中医证型及病理类型之间关系的分析（一）IgA肾病病理分级与P27、PCNA的关系IgA肾病病理分级与P27、PCNA的等级相关（Spearman法）检验显示，P27的表达与病理分级呈非常显著负相关，而PCNA的表达则与病理分级呈显著正相关。对于组间数据行F检验和q检验的结果显示各病理级别间的P27和PCNA表达差异显著或非常显著，组间两两比较也有同样的结论。以上结果显示随着病理分级程度的增高，PCNA的表达增高，而P27的表达则反之。因而，P27和PCNA作为判断IgA肾病肾脏组织学损伤程度和预后的指标值得深入研究。（二）IgA肾病病理分级与中医证型的关系行Ridit检验结果显示，气阴两虚型的病理分级比湿热型和肝肾阴虚型为高；湿热型与肝肾阴虚型的病理分级无显著性差异。三个中医证型之间病理分级差异明显。这与IgA肾病的发展进程是湿热肝肾阴虚气阴两虚有关。而湿热型与肝肾阴虚型的病理分级无显著性差异可能是湿热肝肾阴虚的发展过程不足以导致病理分级的变化所致。（三）中医证型与P27、PCNA的关系现代中医研究发现，IgA肾病的发展过程是湿热肝肾阴虚气阴两虚16。本研究的统计结果显示，在这样一个过程中，P27的表达逐渐减少而PCNA表达呈现逐渐增高的趋势，这就从分子水平映证了这一病机发展过程的正确性。这就提示我们更加注意及时治疗，防止疾病的传变，阻止其向深入发展。自上个世纪七十年代中期以来，有关湿热对肾脏疾病发生发展以及在预后转归中起到的作用开始引起医学科学工作者的普遍关注。从很多医家的临床观察和实验总结的报道来看，应用清热利湿方药为主进行治疗以后，可以使一些难治性的肾病得到缓解，这又从另一方面证实了PCNA和P27的不同表达可以反映IgA肾病中医证型的演进。由此我们又可以推论清热利湿治疗有助于抑制系膜细胞增殖，阻止肾小球系膜细胞损伤逐渐演进的过程。这一点值得进一步研究。肾活组织检查进行P27、PCNA检测可以反映患者当时的系膜细胞增生状态，但是，在实际工作中由于种种原因，重复进行病理检查的可能性较小。因而，本课题所揭示的IgA肾病中医证型与P27、PCNA的关系可以使我们通过辨证间接地大致地推断IgA肾病患者肾小球系膜细胞的增殖状态，具有较大的实际意义。小 结CONCLUSION一、P27、PCNA作为判断IgA肾病肾脏组织学损伤程度和预后的指标值得深入研究。二、IgA肾病中医证型之间病理分级差异显著。气阴两虚证病理分级比湿热证和肝肾阴虚证为高，而湿热证和肝肾阴虚证的病理分级无显著性差异。三、P27与PCNA的不同表达可以反映IgA肾病中医证型的演进。参考文献REFERENCES1 张明,郭慕依,张秀荣,等. 肾小球系膜增生机制的免疫组化研究.中华肾脏病杂志,1995,11(4):208-211.2 叶任高, 陆再英.内科学.第五版.北京:人民卫生出版社. 2001,543.3 Fero ML, Ribkin M, Tasch M, et al. A syndrom of mutiorgan hyperplasia with feathers of gigantism, tumergenesis and female sterility in P27 (Kip1) deficient mice. Cell, 1996; 85:733-744.4 Mathews MB, et al. Identity of the proliferating cell nuclear antigen and cyclin. Nature 1984; 309:374.5 Bravo.R,et.al.Cyclin/PCNA.tein.of.DNA.polymerase.Nature.1987;325:515.6 Darnell J, et al .Molecular cell Biology.2nd ed. Scientific American Books