胚胎干细胞体外培养.doc

胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。(二)胚胎干细胞的分离1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取35天囊胚；猪取910天囊胚；羊取78天囊胚；牛取67天桑葚胚或早期囊胚；人取710天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取12.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或13.514.5天生殖嵴；牛取2935天胎儿生殖嵴；人取3563天的生殖嵴。2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。从囊胚分离ICM的方法主要有三种：(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至16稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hanks液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，46天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。(3)显微外科学方法：小鼠受精后34天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。(三)胚胎干细胞的培养和建系ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs成千上万的克隆。目前建立ESCs系的方法有多种，常用方法包括以下过程：原始ESCs的获得：从受孕动物体内或体外受精卵培养中获得发育至桑葚胚或胚泡阶段的早期胚胎，用机械法分离、胰酶或胶原酶消化桑葚胚或胚泡内细胞团得到原始ESCs悬液。ESCs的传代培养：将原始ESCs悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素C处理的成纤维细胞饲养层上进行培养。培养1周左右，发现典型的ESCs集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后，进行传代培养，35天传1次。经反复传代培养，可获得生长旺盛的高纯度ESCs。ESCs的鉴定。由于ESCs来源于分裂增殖非常活跃的早期胚胎细胞，所以维持其生长代谢所需的营养要充足，用于ESCs培养的饲养层细胞培养基含高糖和谷氨酰胺，同时加胎牛血清、新生牛血清、2-巯基乙醇。高糖的作用是提高ESCs的增殖速度，同时提供饲养层细胞生长所需的能量；谷氨酰胺作为细胞合成蛋白质与核酸的原料，是饲养层细胞培养基的必需品；2-巯基乙醇的作用为促进胚胎细胞的分裂增殖，并可还原血清中的含硫化合物，防止过氧化物对ESCs的损害。1.胚胎干细胞的培养体系：(1)常规培养液：选择和配制高质量的培养基是体外培养ESCs的基本要求。常用的培养基有MEM-、DMEM、TCM-199、F12等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。再加入10%新生牛血清、10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇、100g/ml L-谷氨酰胺。Thomson等建立恒河猴(rhesus monkey)ESCs系时，培养基中补加了1%的非必需氨基酸，结果ESCs生长良好。Gardner和Lane发现，如果培养基中含有输卵管液中高浓度表达的氨基酸成分，胚胎卵裂、囊胚形成和孵化均显著增加。(2)无血清培养基：血清中含有大量促细胞生长因子和多种营养物质，有促进细胞生长繁殖和黏附的作用，但血清中还含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利于ESCs未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液(chemically defined medium)进行ESCs的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，发现ESCs增殖旺盛，且能保持未分化状态。(3)条件培养基(conditioned medium，CM)：Martin曾应用小鼠畸胎瘤多能干细胞系PSA-1的条件培养基建立了小鼠ESCs系，后Axelrod对其进行了改良：将PSA-1畸胎瘤细胞接种于STO饲养层上，在含有10%胎牛血清的DMEM中贴壁培养，达到50%75%汇合时更换培养液，用不含血清的DMEM培养基(加有10mg/ml转铁蛋白、10mg/ml胰岛素)继续培养24小时，收集培养液，离心，去除细胞沉淀，上清液再经过0.22m的微孔滤膜过滤，过滤后的PSA-1培养液再加入10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇，即为PSA-1条件培养基。使用前用含有10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇的DMEM培养基稀释，PSA-1细胞分泌的细胞因子等活性物质的活性基本保持不变。以后许多实验室制备了不同的条件培养基取代饲养层细胞来维持ESCs的生长，如BRL(buffalo rat liver cells)、PC10-6R转染的COS细胞、HBC-5637(5637 human bladder carcinoma cells)、RH-CM(大鼠心肌细胞条件培养基)等，这些条件培养基中都含有高浓度的细胞分化抑制因子，可以抑制ESCs的分化。(4)饲养层(feeder layer)：饲养层是一层经过射线照射或丝裂霉素C处理后用作培养ESCs的底物细胞层。饲养层细胞经射线照射或丝裂霉素C处理后，虽然失去分裂能力，但仍能保持生存，并有同化培养液的能力，为胚胎发育提供一些必需因子，如成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等促有丝分裂因子，LIF等细胞分化抑制因子，促进其增殖，抑制其分化，而且可以除去体外培养环境中的毒素。目前常用的饲养层有：STO、PMEF(primary mouse embryonic fibroblast)、SNL(G418R基因和LIF基因转染的STO)、HBC-5637等。其中PMEF以其易于取材、抑分化效果好等特点而被广泛应用。制备饲养层时，取达到80%汇合的原代鼠胚成纤维细胞，加入含10g/ml丝裂霉素C的培养液，作用24小时后，弃去培养液，用无Ca2+、Mg2+的Hanks液洗涤培养细胞45次后，0.125%胰蛋白酶0.02%EDTA消化制成细胞悬液，接种在涂有0.1%明胶的四孔板中。安立龙等将小鼠ESCs置于衰老饲养层表面进行培养时发现，ESC集落松散，表面及周围形成许多颗粒细胞、巨型细胞和上皮样细胞，认为衰老饲养层能诱导小鼠ESCs的体外分化，所以建议使用新鲜制备的饲养层细胞来分离培养ESCs。2.胚胎干细胞的获取：(1)早期胚胎细胞培养法：早期胚胎细胞培养法是将致密桑葚胚用0.3% EDTA将其离散为卵裂球，并单个培养在STO(原代胎儿成纤维细胞)饲养层上，在培养4872小时后，出现ESCs集落。(2)胚胎与饲养层细胞共培养法：将早期胚胎如桑葚胚、囊胚、扩张囊胚等放置在铺有STO或3T3饲养层细胞的培养液中培养，待胚胎贴壁、透明带脱落、ICM附着增生，出现鸟巢状集落时，挑出ICM，消化ICM为细胞小块，用等体积培养液或胎牛血清中和胰蛋白酶作用，将细胞小块接种在新饲养层上培养，就会获得ESCs。(3)ICM与饲养层细胞共培养法：用免疫外科手术法剥除滋养层细胞，以STO细胞为饲养层，用ESCs条件培养基培养ICM细胞，也可获得ESCs，剥除滋养层的主要目的是防止滋养层细胞对ICM细胞的竞争抑制和诱导分化。(4)原始生殖细胞与饲养层细胞共培养法：将原始生殖细胞PGCs接种于STO饲养层细胞表面，可获得人ESCs。从人流产胎儿生殖嵴分离和克隆人ES细胞，克服了实验材料难以取得的困难，这将会促进与人ESCs相关研究的进行。(5)裸胚与饲养层细胞共培养：用玻璃针刺破囊胚或桑葚胚透明带，将有破口透明带的胚胎置于培养液中培养，次日，ICM就从透明带中脱出贴附于饲养层。透明带坚固、厚、不易破裂的动物胚胎贴壁缓慢，影响ICM增殖，切除透明带，有利于ICM增殖和ESCs形成。而透明带薄，易于破裂的胚胎贴壁不受影响，切除透明带等操作对ICM有不利影响，使ESCs形成率降低。(6)热休克处理胚胎与饲养层共培养：当胚胎在体内发育至2细胞或桑葚胚时，从子宫中取2细胞胚胎或桑葚胚，将胚胎置于41持续1小时，增加胚胎ICM细胞。采用热休克处理胚胎，桑葚胚发育至孵化胚的效率为87%，2细胞胚胎发育至囊胚的比率为85.0%。在胚胎分裂的活跃期用热应激处理胚胎，阻制了胚胎分化，扩大了ESCs分离的时间范围。(7)切割胚胎培养：对早期胚胎进行切割，使胚胎一分为二。若2个半胚均含有ICM和滋养层细胞，半胚可发育为扩大囊胚，大约有35%的半胚可贴附于子宫成纤维细胞滋养层，且对以后的胚胎和胎儿发育无影响。这表明，用切割半胚可以分离ICM和ESCs。(四)小鼠胚胎干细胞分离培养的实验室技术由于ESCs在一般体外培养条件极易分化而失去其多潜能性特点，故需掌握一定的培养技术才能保留其多向分化潜能和体外扩增两大特点。目前，以小鼠ESCs体外培养技术最为成熟，本文将以小鼠ESCs为例，介绍ESCs体外培养和ESCs分离鉴定等实验技术。1.培养基的准备：(1)ESCs培养液：以DMEM(高糖，葡萄糖含量要在4.5g/L以上)为基础液，加入以下成分：NaHCO3 2.2g/L谷氨酰胺 2mM非必需氨基酸 0.1mM-巯基乙醇(-mercaptoethanol)0.1mM或单硫甘油(monothioglycerol)0.15mM庆大霉素50g/ml或青、链霉素各100IU/ml(必要时可不加抗生素)15%胎牛血清(FBS)或10%胎牛血清+10%新生牛血清(NBS)LIF(leukemia inhibitory factor)，可选择性加入，用饲养层细胞饲养ES细胞时，可以不加，或加入5001 000IU/ml，无饲养层细胞饲养时要加1 000IU/ml以上。用超纯水或五蒸水配制，用HCl调pH7.4，过滤除菌，4保存备用。目前GIBCO公司生产了一种KD-SRES细胞无血清培养液，可代替以上培养液使用。(2)STO及MEFs细胞培养液：DMEM(含葡萄糖1.0g/L即可)，10%新生牛血清，青、链霉素各100IU/ml(或庆大霉素50g/ml)，三蒸水配制，过滤除菌，4保存备用。(3)胚胎培养液：M16或DMEM(高糖)+10% NBS+10% FCS+青、链霉素各100IU/ml。(4)消化液：为胰蛋白酶-EDTA溶液。胰蛋白酶干粉 1.25gEDTA 0.2gNaCl 7.0gNa2HPO412H2O 0.3g(或NaHPO47H2O 0.18g)KH2PO4 0.24gKCL 0.37gTris 3.0gD-葡萄糖 1.0g庆大霉素 4万IU(或青、链霉素各10万IU)五蒸水或超纯水 1 000ml过滤除菌，0保存备用。(5)冲卵液：无Ca2+、Mg2+的PBS+10%新生牛血清+青、链霉素各100IU/ml。(6)丝裂霉素C：STO及MEFs细胞培养液加入丝裂霉素C10g/ml，用前配制，4保存，不超过1周，避光。(7)孕马血清(PMSG)及绒毛膜促性腺激素(hCG)：用单蒸水配成浓度PMSG 50IU/ml、hCG 100IU/ml，-20保存备用。(8)冻存液：MEFs和STO及ES细胞培养液+10%15%的二甲基亚砜(DMSO)，用时配制或配制后冰冻备用。(9)PBS缓冲液：使用超纯水或五蒸水配制，高压灭菌或过滤除菌。2. ESCs的培养：由于ESCs在体外培养过程中极易分化，故既要保持其不断增殖又要抑制其分化，则必须将其饲养在能分泌抑制因子的饲养细胞单层上或在培养基中加入分化抑制因子。ESCs的培养包括饲养细胞的培养、饲养单层制备及ESCs培养三部分工作。(1)饲养细胞培养：目前饲养细胞有两大类：MEFs(小鼠胚胎成纤维细胞)和STO(小鼠纤维母细胞株)及已经稳定表达了白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)和neo的STO细胞(如SNL细胞)。MEFs的制备和培养：性成熟雌小鼠(78周龄)与种雄鼠(8周龄以上)12比例合笼，每天早上观察雌小鼠阴道口，有乳白色或淡黄色胶冻状物(阴道栓)即确定为怀孕，见栓当天为怀孕0.5天。取怀孕12.514.5天的雌鼠，脱臼处死，无菌条件下暴露子宫，镊住近子宫颈端分离子宫系膜，剪断子宫角，提起整个子宫，在灭菌滤纸上吸干血迹，置入盛有PBS或无血清DMEM平皿内。沿子宫系膜侧剪开子宫，摘取胚胎，置入另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内充分洗涤，去除残余血迹。用小镊子撕破胎膜，取出鼠胚，去除胚胎头部、内脏、四肢及尾部，将躯干置入另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内，至少洗涤3次，完全去除红细胞。用灭菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm以下的碎块，吸至离心管内。加入等体积胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻吸吹30秒，制成单细胞悬液。加入等体积MEFs培养液终止胰蛋白酶的消化作用，8001 000r/min离心5分钟，弃上清液。加入5ml左右鼠胚细胞悬液，移入培养瓶内(5个鼠胚可使用1个100150ml培养瓶)让细胞悬液能均匀覆盖培养瓶表面(培养液不宜过多)，37、5%CO2、100%湿度孵箱培养。开始培养的前2天不要晃动培养瓶，第3天细胞附着于培养瓶底壁，开始生长，更换培养液，继续培养。第45天，细胞连成一片，即可消化制成细胞悬液，置离心管内静置510分钟，取上清液即为单细胞悬液，以13比例传代，一般采用35代MEFs作饲养细胞用。也可以将鼠胚躯干组织碎块收集于离心管后重复下列操作56次：加入等体积消化液轻轻吹吸30秒加入等体积培养液终止消化静置35分钟收集上层单细胞悬液。最后弃大块组织，将收集到的单细胞悬液离心，8001 000r/min离心5分钟，弃上清液，加入培养液分装至培养瓶内，37、5%CO2、100%湿度孵箱培养。每天观察，及时更换培养液和传代，同样以13比例传代，35代作饲养细胞用。STO细胞的培养：STO细胞是SIM小鼠纤维母细胞的一种耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系细胞，广泛用作多潜能畸胎瘤细胞和ES细胞的饲养细胞，其代替MEFs的优点是：细胞易于生长及不需要经常准备孕鼠，但是STO细胞必须保持在最适生长条件下，否则易于变异，特别是生长密度过大时。目前已有稳定转染了neo基因和LIF基因的STO细胞株(如SNL细胞)，可用于ESCs的转染和筛选。STO细胞的培养按一般细胞株的培养方法即可，培养液与MEFs相同。(2)饲养单层制备：有两种方法，丝裂霉素处理法和射线照射法。一定剂量的丝裂霉素和射线能够使细胞停止分裂，但又保持生存，并分泌抑制ESCs分化和促进ESCs增殖的因子，保证ESCs的生长。丝裂霉素处理法：MEFs或STO细胞融合成单层，弃培养液，加入含10g/ml丝裂霉素C溶液(覆盖细胞单层即可)，37、5%CO2、100%湿度孵箱内放置23小时。吸弃丝裂霉素处理液，用PBS充分洗涤35次，除去残余丝裂霉素C，因其能影响ESCs的生长。用消化液将其消化成单细胞悬液，接种到预先用多聚赖氨酸处理过的培养瓶或培养皿内(多聚赖氨酸覆盖培养瓶或培养皿表面，室温放置2小时以上，用前吸弃多余多聚赖氨酸，直接使用或稍干燥后使用)，调整细胞密度为每毫升3105个。37、5%CO2、100%湿度孵箱培养，细胞很快贴壁并铺展为单层。细胞如果过稀可补加丝裂霉素处理过的细胞，这样制成的饲养单层可使用610天，用前更换ESCs培养液。MEFS或STO细胞单层用丝裂霉素处理及PBS洗涤以后，也可以不消化直接使用。-射线处理法：MEFS或STO融合成单层后，用射线照射，剂量为30100Gy(3 00010 000rad)。余下步骤同丝裂霉素C处理法。照射过的细胞也可以以每毫升5106个浓度冻存备用。(3)从小鼠囊胚内细胞团分离培养原代ESCs：孕鼠的准备及胚胎的采集：性成熟前期雌鼠(昆明鼠大约4周，2426g最好)于1100100或下午400600腹腔注射HMG 510IU/只。4648小时后腹腔内注射hCG 510IU/只，同时以11比例与种雄鼠合笼。第2天上午观察雌鼠阴道栓，见栓者当天为怀孕0.5天。怀孕3.5天(即见栓第4天)雌鼠脱臼处死，无菌条件下打开腹腔，暴露子宫。镊住近子宫颈端，剪断，分离子宫系膜，并于输卵管端剪断子宫角。小鼠为双角子宫，分离后的子宫用无菌滤纸吸干血迹后置于无菌平皿内(直径35mm)。5ml灭菌注射器(平头)吸入冲卵液，从子宫角端进针，针头要保证进入子宫腔内，将冲卵液快速推入子宫腔(每侧子宫0.20.5ml)，胚胎连同冲卵液从子宫颈端排出，要注意用平皿接好排出的冲卵液。将盛有胚胎冲卵液的平皿置于显微镜下(50100倍)，仔细采集胚胎。3.5天胚胎处于囊胚期，但也可能处于桑葚胚期，均可使用。胚胎培养：用胚胎培养液在直径35mm平皿中做成小滴，每个直径35mm平皿可做成4个小滴，上覆盖透明石蜡油。收集的3.5天胚胎置入培养小滴内，37、5%CO2、100%湿度孵箱内培养。每天观察，换液每日12次。待胚胎发育为囊腔充分扩展或突破透明带时移植到MEFs或STO饲养单层(用直径35mm培养皿准备，上覆盖透明石蜡油)上继续培养，此时换上DMEM(高糖)培养液(加10%新生牛血清、10%胎牛血清和双抗)。12天后，胚胎贴附在饲养单层上，滋养细胞扩展成薄薄一层，将饲养细胞推开，内细胞团位于中央向上隆起生长，边缘界限清晰，表面较光滑，结构致密，35天后内细胞团增大，即可做内细胞团分离和早期培养。此期隔日半量换液。(4)内细胞团细胞分离培养：毛细吸管的准备：将18cm巴氏德吸管在火焰上拉细，用砂轮切断末端，准备末端口径比内细胞团稍大或稍小两种。将内细胞团生长良好的培养皿置于显微镜下(50100倍)，用末端口径比内细胞团稍大的毛细吸管挑起内细胞团，收集到覆盖有透明石蜡油的培养小滴内(用胚胎培养时相同的培养液制备)。将内细胞团收集齐后，一同置于覆盖有透明石蜡油的胰蛋白酶-EDTA消化液小滴内，用消化液洗涤1次，弃除残余培养液，加入新的消化液，37作用34分钟。改用末端口径比内细胞团稍小的毛细吸管，轻轻吸吹内细胞团块，至分散成24个细胞在一起的小团块。将含有内细胞团细胞的消化小滴吸至MEFs或STO饲养单层上(预先用丝裂霉素C或射线处理)，换上ES细胞培养液。每天观察，2天后可见ESCs样细胞小集落出现，34天集落进一步增大，67天可按ES细胞培养方法进行消化传代。(5)ESCs的培养：饲养层培养法：将ESCs种植到用丝裂霉素C处理或射线照射后制成的饲养单层上，换上ESCs培养液。37、5%CO2、100%湿度孵箱培养，每天观察，及时更换培养液，每23天以13至16的比例传代。消化时，弃培养液，PBS洗涤1次，加入胰蛋白酶-EDTA消化液，以能覆盖细胞表面为度，作用30秒，弃消化液，让残余消化液继续作用，轻敲培养皿底部，细胞层出现裂隙，细胞纷纷脱落时，加入ESCs培养液，轻轻吹打至成单细胞悬液。正常的ESCs集落边缘清楚、表面平滑、结构致密、隆起生长、碱性磷酸酶检查强阳性。若饲养条件不适，ESCs易于分化，集落变得扁平，边缘不清楚，表面粗糙，见有较大内胚层样结构，碱性磷酸酶检查阴性。无饲养层培养法：LIF的使用：于ESCs培养液中加入LIF，浓度1 000IU/ml即可在无饲养层的情况下培养ESCs。Buffalo大鼠肝细胞(BRL)条件培养基(BRL-CM)的使用：BRL是一种细胞株，能分泌LIF，故收集其上清液可用于ESCs的培养。方法是：以2105个/ml浓度种植细胞，培养72小时，收集上清液，使用的培养液为不加LIF的ESCs培养液。培养上清液使用前过滤弃细胞碎片。使用时，67份培养上清液加34份新鲜不加LIF的ESCs培养液，再加入8%10%的胎牛血清，组合成BRL-CM培养基，培养ESCs时不加饲养层，同LIF一样可保持ESCs未分化状态和多向分化潜能。大鼠心肌条件培养基(RH-CM)的使用：23周龄大鼠的心肌细胞培养上清液也有BRL培养上清液类似的作用。方法是：将23周龄的大鼠心肌制成单层细胞，以12传代，收集5代内的培养上清液。所用的培养液为不加LIF的ESCs培养液。培养上清液使用前过滤弃细胞碎片，使用时6份培养上清液加3份新鲜不加LIF的ESCs培养液，再加1份胎牛血清，组合成RH-CM。无饲养层培养的ESCs，呈岛屿状生长，克隆的特征性形态更清楚。3.ESCs的冻存与复苏：由于胚胎干细胞来源较少，这就需要通过体外扩增以获得足够数量的胚胎干细胞。但是在长期的细胞培养过程中，可能会出现微生物污染或基因型改变等情况，从而导致具有优良特性的细胞系丢失，为防止干细胞丢失，胚胎干细胞在体外的合理冷冻与复苏并无限期保存将成为关键。如需要将ESCs冷冻，最好在培养早期进行，选择细胞形态及核型均正常的细胞冷冻，并在液氮中长期保存。方法同一般细胞株的冻存与复苏方法，冻存液则是在培养液的基础上加10%15%DMSO(最好用时配制)。复苏溶解后一定要尽快加培养液稀释冻存液，减少DMSO对细胞的毒性作用，离心，弃上清液，重新加培养液培养。(1)ESCs的冻存：冷冻保护剂：冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，可分为渗透性和非渗透性两种。不同的冷冻保护剂有不同的优缺点，如DMSO虽然是一种最优先选择的、最有效的、广泛使用的冷冻保护剂，其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩，但它本身有一定的毒性，可以和不溶于水的蛋白残留物起反应，导致蛋白的变性和破坏。如何充分发挥DMSO低温保护细胞的效应，又能有效降低其细胞毒性作用，是ESCs低温保存的主要问题。保存温度：虽然有研究表明-196冷冻的干细胞，细胞的增殖和分化能力改变很小，但由于程序降温，液氮保存设备昂贵、费时、难以普及，故人们一直寻求一种更简单、可靠的方法来保存ESCs。-80直接冷冻保存ESCs逐渐显示其优越性，并受到广泛的重视和推广。冷冻方法(以小鼠胚胎神经干细胞为例)：对需冻存的细胞从胎脑和脊髓中分离到的原代细胞或经体外培养处于对数生长期的细胞进行计数，收集细胞至离心管，于4 15 000r/min离心10分钟后吸弃上清液，按冷冻细胞所需浓度每毫升(12)106细胞，定量加入预冷的神经干细胞冻存液，充分混匀后，将此细胞悬液转移到冷冻管中，每管1ml，封口做好标记。将冷冻管放入隔热的泡沫塑料盒内，直接放入-80低温冰箱过夜，翌日转入液氮中保存。(2)ESCs的复苏：解冻过程也可影响到细胞的活性。许多研究已证明，复温速度越快越好，通常是在3740的水浴中解冻2分钟左右，快速复温可避免重结晶现象的发生，使冻存的细胞复苏后仍保持其正常的结构和功能。以小鼠胚胎神经干细胞为例，将冷冻管迅速由液氮转入到3740水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免污染，不定时搅拌加速解冻。当细胞将要完全解冻时，用含70%乙醇的消毒棉擦拭冷冻管消毒，将细胞转移到含有4预冷的神经干细胞复苏液的试管中(按110的比例)，1 500r/min离心10分钟，去除DMSO，将细胞重悬于新鲜的干细胞培养液，用培养液调节细胞至适宜浓度，并将细胞转移到细胞培养瓶，于CO2培养箱中培养。4.ESCs的鉴定：ESCs是一种正常的胚胎性干细胞，具有正常二倍体核型、体内外分化能力及整合到宿主内细胞团并共同发育成嵌合个体的能力，但其易分化变异，引起这些能力的减弱甚至消失，故对ESCs长期传代培养时要及时进行ESCs核型的鉴定、体内外分化能力及嵌合能力的观察，以判定ESCs是否发生分化。(1)形态鉴定：ESCs胞体较小，核大，有1至多个核仁，细胞致密，细胞间无界限，ESCs集落形似鸟巢，集落周边整齐，与饲养层界限分明。(2)核移植：ESCs最重要的特性即全能性。以待测细胞作为核供体注射到去核的卵母细胞中，观测该重构胚是否能够正常发育并产生后代，进而确定是否为ESCs。这是一种最可靠的鉴定方法。(3)核型鉴定：ESCs应具备正常的二倍体核型。高分辨率分带技术如染色体G带技术可精确地识别染色体，判断核型是否正常。(4)碱性磷酸酶(AKP)活性检测：ESCs中AKP具有较高的活性，而在已发生分化的ESCs中AKP的表达骤然降低，甚至是不表达，故可以通过AKP活性检测来判断ESCs是否发生了分化。用染色液固蓝RR或固绿B盐、萘酚AS-TR磷酸盐进行鉴定，阳性染色细胞为红色，阴性无色。(5)Oct-4活性检测：Oct-4是维持细胞多能性的一个重要转录因子，是POU家族成员。有资料表明缺乏Oct-4的胚胎在附置后不久死亡，因为其ICM不能正常发育，OCT-4是细胞具有全能性的标志。ES细胞中含有OCT-4基因，经OCT-4基因产物的免疫荧光检测ESCs可呈阳性着色。(6)体外分化能力观察：将ESCs按常规方法消化，但不要吹打成单细胞悬液而让其保持团块状。移至无饲养层培养瓶(皿)内，培养液中不加LIF，胎牛血清浓度降至10%。按常规培养条件培养，每天观察，轻轻晃动培养瓶(皿)或用吸管吹打，每天23次，不让ESCs团块贴壁和粘连在一起，必要时更换部分培养液。每天观察，一般3天左右ESCs团块开始分层，外部一层是较大的内胚层样细胞，内部细胞小而紧密，为外胚层样细胞和干细胞。此时为简单类胚，培养至510天，分层增多，并逐渐出现囊腔，最终细胞团胀大成圆泡状，为囊状胚。如果细胞团贴壁并且分化，长出如上皮细胞、神经细胞、成纤维细胞等多种细胞，将这些细胞团挑出固定，可初步了解其分化时间和分化能力的强弱。不同的ESCs分化能力不同，根据其分化程度的不同，可初步了解其分化能力的强弱。(7)体内分化能力的观察：取生长良好的ESCs，按常规方法消化制成单细胞悬液。8001 000r/min离心510分钟，弃上清液。加入少量培养液，调成高浓度细胞悬液(约1108个/ml)。取同种小鼠，腹股沟注射ESCs高浓度悬液，每只鼠约1107个细胞。或接种裸小鼠腹股沟皮下，每只鼠1106个细胞即可。小鼠接种细胞后放回笼内饲养，约2周腹股沟注射处出现肿块，45周后，肿块进一步增大，处死小鼠，摘除肿块。肿块一部分固定，切片，染色，观察；另一部分消化制成单细胞悬液(方法同MEFs的制备)体外培养。继续观察，切片中可见属于各个胚层的分化组织，如各种上皮组织、神经纤维、角质化的复层扁平上皮、肌肉组织、软骨、硬骨、腺腔、神经管以及干细胞巢等，为畸胎瘤结构，恰如将小鼠胚胎异位移植后的结果。体外培养的细胞见有多种细胞生长，如上皮细胞、骨骼肌细胞、神经细胞、成纤维细胞、心肌细胞以及干细胞集落等等。腹腔注射，剂量同腹股沟接种。见小鼠腹部逐渐胀大，23周后，处死小鼠，打开腹腔，可见大小不一畸胎瘤肿块游离或粘连在肠系膜上。同样可摘除固定、切片、染色以及体外培养，观察方法同上。(8)嵌合能力观察：将ESCs注射到宿主囊胚腔内，可与宿主内细胞团细胞发生整合共同发育成个体，即嵌合体(chimera)。来源于不同动物品系的ESCs，有不同的遗传特点，通过这些遗传特性的观察，可确定ESCs是否整合、分化、发育，目前最常用的方法是对新生个体毛色的观察。确定ESCs的来源及选择宿主鼠品系：大多数ESCs来源于129品系小鼠。129小鼠毛色为野灰色，应选择白化体鼠(如BALB/c)和非野灰色鼠(如C57BL/6)；也有来源于C57BL/6鼠的ES细胞，则应选白化体鼠(如BALB/c)和野灰色鼠(如129鼠)，产生的嵌合体应是花色鼠，被毛是白色和野灰色或黑色相间，眼睛虹膜为野灰色或黑色。准备3.5天受体囊胚(同前)。生长良好的ES细胞消化制成单细胞悬液。应用显微注射仪将ESCs注射到受体囊胚腔，每个囊胚510个ES细胞。将注有ESCs的囊胚移植到假孕鼠子宫腔，使之发育并产下个体，鉴定嵌合情况(图16-1)。图16-1 嵌合体的制备过程5.操作注意事项： (1)定期将未分化的细胞集落从已分化的细胞中分离出来并接种到新的培养基上。(2)转移细胞时尽量快，以免细胞发生解离和死亡。(3)分离细胞集落时使每个部分含510个细胞，否则细胞过多将导致分化，细胞过少则克隆的效率低。(4)由于ESCs是对各种内毒素最为敏感的细胞，故要重视培养液和血清的质量。(5)重视原始饲养层细胞的质量，没有原始饲养层细胞所在的胚胎干细胞将在710天内分化或死亡，若原始饲养层细胞质量差，则不能有效地抑制ESCs的分化而导致培养增殖失败。6.技术问题讨论：(1)培养液：ESCs的培养液比较特殊，需要使用高糖的DMEM，葡萄糖的浓度要在24.8mmol/L(4 500mg/L)以上，要加上巯基-乙醇(0.1mM)或单硫甘油(0.15mM)，有时还要补充丙酮酸钠(1mM)和谷氨酰胺(2mM)以及非必需氨基酸(0.1mM)和抑制分化的LIF。血清浓度也较高，用10%胎牛血清和10%新生牛血清或用15%胎牛血清。碳酸氢钠的用量2.2g/L比3.7g/L可能效果更好。配制培养液必需使用无细菌内毒素污染的超纯水或五蒸水。细菌内毒素是一种脂多糖，是革兰阴性菌的细胞壁成分，很低浓度也会影响ES细胞的增殖。离子交换柱使用时间久，细菌会生长在树胶的表面并释放内毒素到过柱的超纯水中，故用玻璃蒸馏水器制备的五蒸水可能比用离子交换柱制备的超纯水要好。超纯水和五蒸水要现用现制备。目前GIBLO公司生产一种无血清ESCs培养液，可代替传统的培养液。血清成分复杂，不利于整合到ESCs基因组中的外源性基因功能的测定，所以无血清培养基更好。(2)血清：使用胎牛血清作为ESCs培养液的组成部分。选择一批最适于ESCs生长的胎牛血清很重要，一旦确定最好批次，最好贮备同批足量血清备用。可在平板皿内(每6cm