脂肪酶活检测原理及方法.doc

脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。2.所需试剂有：CAS 碳链长度 出货号 价格 名称830-03-5C2N8130-1G ￥462对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8C18 N3627-1G￥2621.97 对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma公司3. 标准曲线绘制：a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L):称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4冰箱保存。方法一：b.标准曲线绘制：分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。b.标准曲线的绘制：分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45L的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5L的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，4015min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。 上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm下测定吸光值,以1 min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1mol对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。公式y=14.474x+0.0272中x是p-NP的浓度(单位：mmol/l)，y是吸光值，14.474、0.0272是反应系数，R2是相关系数。则，酶活计算公式为：酶活=1000*n*V*(y-0.0272) / 14.474t 其中n为稀释倍数，t为反应时间（单位：min），V为反应体系的总体积（单位：L）、1000是mmol到mol的比例。2、 底物耐碱性测定及试验液配制1. 底物耐碱性测定a.6种底物分别加至pH7，pH8的37的PBS缓冲液中（选择37培养箱），每隔5min检测一次颜色变化，拍照；b.6种底物分别加至pH8，pH9的Tris-HCl缓冲液中（37），每隔5min检测一次颜色变化，拍照；c.分别加至pH9，pH10的Gly-NaOH缓冲液。2. 测酶活所需要试剂的配制，酶活测定方法方法一：（96孔板法，粗略，速度快）a. 溶液的配制溶液A：溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP，Sigma，或者其他底物，337.52g/mol，即8.89*10-5mol)溶于10.00ml异丙醇（浓度为8.89*10-3M，或8.89mM），4棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶500次测定；溶液B:缓冲液(pH缓冲液，可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100，混匀，4保存。96孔板（220L）： A液（底物液） ：18L 体系液180（L） + 酶液（40L） B液（pH缓冲液）：162L此步骤中，底物再次被稀释，浓度为0.889mM。方法二：（吸光度法，精准，速度慢）a.溶液的配制溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP，Sigma，或者其他底物)溶于10.00ml异丙醇，4棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶8-10次测定，或用于8-10个酶一次测定，或用于一个酶4次密精测定；溶液B:缓冲液(pH缓冲液，可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100，混匀，4保存。b.脂肪酶的活力测定（以单个酶液做一个 / 两个 对照为例）准备试管30个，10个15ml离心管；取1ml / 1.2ml溶液A加入到9ml / 10.8ml溶液B于离心管中，充分混匀，37水浴保温5min，分装至3 / 4个试管中，每个2.7ml，即体系液；向每个试管中加入适量酶液（粗酶液加300 L），对照组中加入灭活酶液(沸水煮沸5min)，加入酶液后即为反应液；37反应10-15min，加入95%乙醇终止反应，在410nm下测定吸光值，每个样品重复2 / 3次，取平均值。三、96孔板装样方式：步骤一：温度不变，定为40，以pH和底物为变量，先在EP管内反应，后加入至96孔板中。其中每个孔是220L体系。pH缓冲液分别采取PBS缓冲液（7、8）、Tris-HCl缓冲液（8、9）。a.该方法需要的总酶液量（每个酶的单次实验）：40*80=3.2ml，其中需要灭活的是800L。以方便计算以及加样，取4ml酶液，1ml用来灭活。b.该方法需要的单个底物的总量是（每个酶的单次试验）：18*16=288L，以方便计算和加样，取300L。c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例，需要每个酶液4ml，每个底物900L。 表为96孔加样模式：C2等代表底物，后面的数字代表pH，红色字体表示一个空白对照和三个平行。蓝色字体中，pH8分别用了PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液，以便比较不同缓冲液对酶活的影响。123456789101112AC2 7 空白C2 7平行C4 7 空白C4 7C8 7 空白C8 7C12 7 空C12 7C16 7 空C16 7BC2 7平行C2 7平行C4 7C4 7C8 7C8 7C12 7C12 7C16 7C16 7CC2 8 空白C2 8C4 空白C4 8C8 空白C8 8C12 空白C12 8C16 空白C168DC2 8C2 8C4 8C4 8C8 8C8 8C12 8C12 8C16 8C168EC2 8Tri 空白C2 8TriC4 8Tri 空白C4 8TriC8 8Tri 空白C8 8TriC12 8Tri 空白C12 8TriC16 8Tri 空白C16 8TriFC2 8TriC2 8TriC4 8TriC4 8TriC8 8TriC8 8TriC12 8TriC12 8TriC16 8TriC16 8TriGC2 9Tri 空白C2 9TriC4 9Tri 空白C4 9TriC8 9Tri 空白C8 9TriC12 9Tri 空白C12 9TriC16 9Tri 空白C16 9TriHC2 9TriC2 9TriC4 9TriC4 9TriC8 9TriC8 9TriC12 9TriC12 9TriC16 9TriC16 9Tri步骤二：pH不变，以温度和底物为变量，先在EP管内反应，后加至96孔板中。其中每个孔是220L体系。a.该方法需要的总酶液量（每个酶的单次实验）：40*60=2.4ml，其中需要灭活的是600L。以方便计算以及加样，取3ml酶液，750ml用来灭活。b.该方法需要的单个底物的总量是（每个酶的单次试验）：18*12=216L，以方便计算和加样，取250L。c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例，需要每个酶液3ml，每个底物750L。表为96孔加样模式其中C2等代表底物，后面的数字代表温度，红色字体表示一个空白对照和三个平行。40因已经在上个步骤中做过，不再重复。123456789101112AC2 30空白C2 30平行C4 30空白C4 30C8 30空白C8 30C12 30空白C12 30C16 30空白C16 30BC2 30平行C2 30平行C4 30C4 30C8 30C8 30C12 30C12 30C16 30C16 30CC2 50空白C2 50C4 50空白C4 50C8 50空白C8 50C12 50空白C12 50C16 50空白C