三种甘蓝雄性不育类型花粉发育的细胞学观察毕业论文.doc

首都师范大学本科毕业论文三种甘蓝雄性不育类型花粉发育的细胞学观察Cytological analysis of microsporogenesis in three kinds of cabbage male sterility 中文摘要 本实验利用光学显微和电子显微镜在细胞水平和亚细胞水平对三种我国研究和利用较多的甘蓝雄性不育类型进行了较为系统全面的雄性败育特征和时期分析。实验结果表明，隐性核不育类型主要败育时期为减数分裂期，主要败育特征为花粉母细胞期绒毡层细胞和中层细胞异常且异常特征在不同植株上表现不一致，四分孢子正常释放后不能形成正常花粉壁，并迅速败育; 萝卜胞质不育类型萝卜胞质不育主要败育时期在四分体前期，败育特征主要表现为从减数分裂后期开始绒毡层细胞活动异常,绒毡层细胞进行性加厚，其大部分四分孢子能自由释放但受绒毡层细胞挤压败育，其小孢子外壁孢粉素沉积延迟，但最终能发育出较为完全的花粉外壁；显性核不育主要败育时期在四分体后期，主要败育特征是小孢子不能自由释放，但花粉壁能正常沉积孢粉素，包裹在四分体外的胼胝质降解延迟，而花粉母细胞壁直到花粉成熟仍不能降解。关键字：甘蓝 (Brassica oleracea)，雄性不育，细胞学观察，小孢子发育AbstractThe microsporogenesis of three kinds of male sterility in Brassica oleracea Var. capitata were investigated by using light microscope(LM) and transmission electron microscope(TEM). Study here suggested that the first sign of significant phenotype of Ms-cr1 was abnormally developed tapetum and middle layer cells at the stage of meiosis. Free microspores did not form exine and degenerate soon after releasing from tetrads. In the Ogu CMS, the microspore disruption was closely correlated with occurrence of tapetal abnormal. After the completion of meiosis, the tapetum cells showed an abnormal increase in size and the released microspore with normal exine were squashed and degenerated soon.The development of microspores in Ms-cd1 was comparable to fertile plants up to the time of tetrad formation. After the completion of tetrads stage, the separation of microspores from each tetrad in the mutant was arrested .The microspores with developing bacula and tectum in Ms-cd1 still adhered together. The callosic wall of the mutant around the microspores degenerated much slower than that of wild type. The pollen mother cell wall surrounding the developing microspores in Ms-cd1 remained un-degenerated till very late pollen stage. Key words: cabbage(Brassica oleracea)，male sterility，cytological observation， microsporogenesis目录0引言11 材料与方法11.1 实验材料11.2 实验方法21.2.1光学半薄切片制备和观察21.2.2透射电镜样品制备和观察32 结果与分析32.1 可育花药及小孢子发育32.2 隐性核不育花药及小孢子发育过程42.3 萝卜胞质不育花药及小孢子发育过程52.4 显性核不育花药及小孢子发育过程53 讨论63.1 三种雄性不育类型花药发育的主要败育特征比较63.2 药壁组织与小孢子的协调作用74 小结7附录（一）8图1 正常可育花药发育过程光学显微观察8图2 正常可育花药发育电镜观察9图3 隐性不育花药发育过程光学显微观察11图4 隐性不育花药发育电镜观察12图5 Ogu萝卜胞质不育花药发育过程光学显微观察14图6 Ogu萝卜胞质不育花药发育电镜观察15图7 显性不育花药发育过程光学显微观察16图8 显性不育花药发育电镜观察18图9 甘蓝可育花药的发育过程19附录（二）20参考文献21致谢220引言甘蓝是世界上普遍种植的一种芸苔属蔬菜作物，具有很强的杂种优势。植物雄性不育是杂种优势利用的基础，现在利用雄性不育进行杂交制种已成为许多作物育种的主要方向和目标，并在生产上取得了很大地成功，世界各国已广泛应用雄性不育系进行F1杂交新品种的选育，如我国杂交水稻种植面积占水稻总面积的46%-55%，其产量较常规品种增产20%-30%。阐明植物雄性不育形成的分子机理，不仅是花粉发育分子生物学的一个重要课题，也是人工控制植物育性的基础。确定育性基因在花药发育过程中的表达时期将为阐明植物育性机制和创造新型雄性不育材料提供重要依据，大量的研究工作者在力图搞清植物花粉发育的分子模式,以便更好地研究和控制植物的生殖规律。目前国内研究较多的甘蓝雄性不育类型有四种，分别是黑芥胞质NiCMS,隐性不育MS-cr1,萝卜胞质不育Ogu CMS,显性不育MS-cd1。研究不同甘蓝雄性不育的花药发育特征不仅可为促进四种不育类型材料在遗传育种上的应用提供参考，同时也可为准确地确定甘蓝小孢子正常发育过程中不同时期育性相关基因的表达，阐明甘蓝雄性不育形成机制提供理论依据。中国农科院蔬菜花卉研究所最早对甘蓝的四种不同雄性不育性状的花药发育进行了细胞学初步研究。卞春松通过石腊切片光学显微观察【4】，初步证实不同甘蓝雄性不育具有不同细胞学发育过程的终止点。刘玉梅对显性不育材料通过电子显微镜观察证实其败育高峰在花粉母细胞至小孢子单核期【6】，主要特征是四分小孢子不能分开。但在超微结构上对其它雄性不育类型进一步探讨败育机理的分析尚未见报道。本研究通过树脂超薄切片光学观察和电子显微镜观察结合，对其中的三种（隐性不育MS-cr1,萝卜胞质不育Ogu CMS,显性不育MS-cd1）雄性不育类型花药败育特征在细胞水平和亚细胞水平进行深入细致的研究，阐明甘蓝雄性不育的花药败育分子机理提供形态学证据。1 材料与方法1.1 实验材料以中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝课题组经多代回交获得的三种甘蓝雄性不育类型及作为对照的对应的可育回交亲本共4种材料为试材（见表2.1），2005年春天植株开花后取每一个株系的完整花序，根据可育花蕾大小与花药发育时期的相关性，按照花蕾的着生顺序，从下往上(花蕾由大到小)进行分级，将4种材料的不同发育时期的花药剥离出来并迅速沉入2.5%戊二醛（配方见附录二）中，室温下固定8小时。 试材代号雄性不育类型雄性不育来源对应可育材料代号376隐性不育 Ms-cr183121ms530592萝卜胞质不育Ogu CMSCMSR3530680显性不育Ms-cd179399530表2.1三种甘蓝雄性不育材料的来源1.2 实验方法1.2.1光学半薄切片制备和观察1.2.1.1清洗固定后的材料在室温下用PH=7.0、浓度为0.2M磷酸缓冲液(PBS)（配方见附录二）清洗34次，每次约2小时。1.2.1.2脱水清洗后进行脱水，本试验先采用酒精，一般浓度依次为 30%-50%-70%-80%-90%-95%-100%在4冰箱中进行，每次15分钟，再一次100%的酒精脱水室温20分钟。接下来纯丙酮脱水三次，每次15分钟，室温进行。1.2.1.3渗透 实验中用国产环氧树脂618（配方见附录二）作为包埋剂,配方见附录。脱水完毕后，用包埋剂：丙酮以2：1的比例配制混合浸透液，在35的温箱中浸透2小时。之后用纯包埋剂在35的温箱中浸透过夜。1.2.1.4包埋与聚合将渗透过夜的材料转入包埋模具，加上新的包埋剂，起始温度为 40，终了温度大约为60，大约每12小时调高34，使其逐渐聚合。1.2.1.5修块包埋块的修整首先用单面刀粗修，然后再用双面刀细修。包埋块的顶面修成梯形或长方形，顶面的上下两边要平行，块的顶端修成金字塔形，金字塔的斜面应以45度坡面为宜。最后将样品露出，以便切片。1.2.1.6切片及染色包埋块在LEICA ULTRACUT R切片机上用玻璃刀切成半薄切片，切片的面积3 mm2左右，厚度大约3000nm左右，挑切片于滴有蒸馏水的载玻片上，在酒精灯上展片，直至水干，切片粘在载玻片上。在片子上滴上1的龙胆紫染料(或结晶紫)（配方见附录二），染四到五分钟，用蒸馏水将多余染液冲掉。将经过染色的片子用清水清洗后，盖上盖玻片，用LEICA全自动显微镜镜检并选取清晰的雄蕊精细结构用Nikon Coolpix4200 (Japan)数码照相机照相。1.2.2透射电镜样品制备和观察1.2.2.1清洗用2.5%戊二醛固定后的试验材料，用浓度为0.2M，PH=7.2的磷酸缓冲液(PBS)清洗，冲洗2小时，中间换4次缓冲液。 1.2.2.2脱水和置换清洗后进行脱水，本试验是先采用酒精脱水,一般的浓度依次为 30%-50%-70%-80%-90%-95%-100%在4冰箱中进行，每次15分钟，再一次纯酒精室温脱水20分钟。接下来纯丙酮脱水三次，每次15分钟，室温进行。1.2.2.3渗透和聚合 实验中用国产环氧树脂618作为包埋剂，置换后的试材用包埋剂和丙酮混合浸透液(2：1)，在35温箱中浸透2小时后用纯包埋剂在35温箱中浸透过夜。渗透过夜的材料转入包埋模具，加上新的包埋剂，40加热聚合12小时后逐渐调高温度至硬化后调至60直至聚合（大约每12小时调高34）。1.2.2.4切片及染色包埋块在LKB8800III型超薄切片机上，用玻璃刀进行超薄切片，用铜网捞片后用醋酸铀和硝酸铅（配方见附录二）染色后，在日立H-7500透射电镜下进行观察照相。2 结果与分析2.1 可育花药及小孢子发育甘蓝可育花药的发育过程相对简单（图9），正常可育雄蕊原基上分化出花药原基，花药原基细胞不均衡分裂形成四裂瓣状，进一步发育形成花药的4个小孢子囊，药壁组织平周分裂形成外表皮、内表皮、中层和绒毡层四层细胞(图1A， 2A)，造孢细胞进一步分化形成排列紧密的小孢子母细胞(图1B，2B), 每个小孢子母细胞减数分裂形成二分体，并进一步形成四分体(图1B，1C)。此时，中层已部分降解，到四分体期只剩下退化后的残迹(图2D)，但其它孢子体组织仍很正常，内部的绒毡层仍紧紧与花药壁相连，并作为分泌层(图1C，2D)。甘蓝的绒毡层细胞是双核或多核的，绒毡层细胞不仅为提供小孢子发育的营养【1】，而且分泌孢粉素前体，并聚合在小孢子的初生外壁上进而形成花粉外壁【2】，绒毡层细胞的另一个功能是分泌-1,3-葡聚糖酶或胼胝质酶，从而将游离小孢子从包裹在胼胝质中释放出来(图1D) 【3】。单核小孢子时期，药壁外层和内层液泡膨大，绒毡层细胞降解，花粉外壁部分形成(图2H)。随后紧邻外表皮的内表皮细胞，细胞壁加厚，导致花药的机械开裂并释放花粉(图1F)。在花药开裂前，游离小孢子进行一次非对称分裂形成二核花粉，含有一个大的营养细胞和小的生殖细胞，生殖细胞再进行一次有丝分裂形成最终成熟的三核花粉(图1E)。在电镜下观察其花药及小孢子发育过程的超微结构。在花粉母细胞时期，花药各组织已经分化完全，孢子囊和四层细胞清晰可辨(图2A)，花粉母细胞结构整齐、排列紧密、细胞核大、居中、核膜清楚、核仁大(图2B，2C)。四分体时期，中层细胞退化 (图2D)，绒毡层细胞结构清晰，开始液泡化(图2E)，四分孢子核大、居中、核质、胞质稠密、线粒体丰富，外被一层厚厚的胼胝质(图2E，2F)。单核小孢子时期，药壁外层和内层细胞液泡化膨大，绒毡层细胞降解，花粉外壁部分形成(图2H，2I)。单核晚期形成中心大液泡将核挤向一边，小孢子壁继续增厚(图2K)，成熟花粉粒形成覆盖层，基粒棒，基底层 (图2L)。2.2 隐性核不育花药及小孢子发育过程 隐性核不育Ms-cr1表现为：四分体形成后迅速败育，绒毡层直至小孢子成熟时尚未解体(图3E)，部分花药绒毡层细胞在花粉母细胞期就脱离药壁(图3B2，3D2)，部分绒毡层细胞则未脱离药壁但其绒毡层细胞明显较厚(图3B1，3D1)。中层细胞退化也不一致，在绒毡层未脱离药壁的花药中，在小孢子释放期仍表现完好(图3D1)；而在绒毡层脱落的花药中，在花粉母细胞减数分裂时已经降解完全(图3B2)。表明在花粉母细胞时期，可能其Ms-cr1基因已经开始表达，但受其它基因或环境因素的作用造成其绒毡层不同的异常表型。 其能形成正常的四分体(图3C)，四分孢子可正常分开(图3D1，3D2)，而内壁细胞在花药开裂前后部分结构破坏，分解成一层黑色残迹(图3E，3F)。 透射电镜结果表明花粉母细胞数量较少且排列不紧密，四层药壁细胞液泡化较为明显(图4A，4B，4C)，其中层细胞受挤压狭长(图4B)，四分体可以正常形成(图4E，4G)，但绒毡层细胞壁厚且径向伸长，较为肥大，可以形成双核或多核细胞(图4E，4F，4G)，其小孢子可以正常释放，但中层细胞此时仍未降解(图4H)，其小孢子能形成外壁内层，但没有沉积孢粉素，且形状不规则(图4I)。双核期至三核期，绒毡层迅速降解，花药外壁膨胀而内壁降解，败育花粉沉积在药壁上，败育花粉残迹无基粒棒(图4J,4K，4L)。2.3 萝卜胞质不育花药及小孢子发育过程萝卜胞质不育Ogu CMS类型败育特征主要表现为：从减数分裂后期开始绒毡层细胞活动异常,绒毡层细胞进行加厚(图5B，5C，5D)， 膨大的绒毡层细胞阻碍了小孢子发育，从空间上压迫了小孢子破坏了其结构，有些绒毡层细胞形成两层细胞并有一层伸入药腔内(图5B)，而中层细胞直至花药开裂并未退化(图5B，5E，5F)，四分孢子能正常形成(图5C)，少部分四分孢子不能正常释放，但大部分小孢子能从胼胝质的包裹中释放出来并体积略有增大(图5D)，随后小孢子迅速退化(图5E)，而绒毡层细胞也迅速退化完全并有残余物沉积在药腔内(图5E，5F)，其内壁细胞也不能发生次生加厚，从而造成花药壁内陷。电镜照片可以清楚地看到，花粉母细胞发育基本正常，只是其数量较少，母细胞壁较厚(图6A，6B，6C)，但此时绒毡层细胞已表现出旺盛的生活力，其细胞核较大。四分体时期能形成正常四分体，胼胝质清晰(图6D，6G，6H)，但可见绒毡层细胞肥大，生活力旺盛，径向伸长并异常增生膨大(图6D，6E，6F)，小孢子可以自由释放，但被进行性增厚的绒毡层挤压在一起(图6I) 。综上所述，其小孢子在四分体结束后可以自由释放，但受异常增生的绒毡层挤压而败育，绒毡层的异常增生应该是导致其败育的直接原因，但部分中层细胞直至花药开裂仍不能降解，以及其花粉壁延迟形成，也可能是萝卜胞质不育相关基因导致的重要败育特征。 2.4 显性核不育花药及小孢子发育过程 显性不育MS-cd1在四分体前发育基本正常(图7A, 7B, 7C)，可以形成基本正常的四分孢子(图7C)。其最明显败育特征表现为：四分孢子在四分体形成后不能从胼胝质壁里释放出来(图7D)。在随后的发育过程中有少部分游离出的小孢子的体积略有增加，但大部分不能分开的小孢子仍粘合在一起，而不膨大(图7E)，直至花药开裂，几乎所有未退化的四分小孢子仍紧紧地粘在一起(图7F)。显性不育的绒毡层细胞发育过程基本正常，随着小孢子的发育可正常退化(图7E，7F)。中层细胞的退化与可育材料也未见有明显差异(图7C，7D)。 电镜观察可以清楚地看到，花粉母细胞发育正常，核居中，核膜清晰(图8A，8F) ，有一层清晰可见的花粉母细胞壁(图8C)，细胞器丰富，线粒体正常(图8D)，唯一较明显的差异是，花粉母细胞期四层细胞液泡化较明显(图8B)，四分体能正常形成(图8H，8G，8I)，四分体以后的药壁组织如中层细胞和绒毡层细胞均能正常降解(图8J，8K，8L)。但在单核小孢子期，尽管四分体内小孢子已经有正常的花粉壁沉积(图8M)，但四个小孢子仍粘在一起不能分开。包裹在小孢子周围的胼胝质(-1,3-glucan)要比可育材料降解缓慢(图8M，8N)，在电镜下可以观察到，胼胝质至花粉发育后期逐渐消失(图8M-8P)。然而，围绕在四个小孢子外的一层很薄的膜(花粉母细胞壁)(图8N)，直到花药发育晚期仍清晰可见。此时，败育的空腔花粉仍粘在一起具有不规则的花粉壁结构(图8Q，8U)，除了小孢子发育的败育特征，花药壁包括绒毡层，中层和外表皮均基本与可育材料一致(图8O，8R)。表明甘蓝显性不育小孢子不能正常分开主要是因为花粉母细胞壁不能降解而不是胼胝质的延迟降解。3 讨论3.1 三种雄性不育类型花药发育的主要败育特征比较迄今为止，在甘蓝类蔬菜中发现的不育材料有14个核不育材料和11个异源胞质不育材料。早在1994年，卞春松通过石蜡切片观察并比较了四种甘蓝雄性不育的细胞学败育特征【4】。本实验利用更为先进的树脂半薄切片及超薄切片技术，分别对三种雄性不育类型的细胞结构和亚细胞结构进行了全面的分析，以期为进一步阐明甘蓝雄性育性形成的分子机理提供理论依据。实验结果表明，隐性核不育类型主要败育特征为：花粉母细胞期绒毡层细胞和中层细胞发育异常，且异常特征在不同植株上表现不一致，四分孢子正常释放后迅速败育彻底；萝卜胞质不育类型败育特征主要表现为：从减数分裂后期开始绒毡层细胞活动异常,绒毡层细胞进行加厚，其大部分四分孢子能自由释放但受绒毡层细胞挤压败育，但与卞春松不一致的是，电镜照片清楚地表明其小孢子外壁孢粉素沉积延迟，但最终能发育出较为完全的花粉外壁，这可能是由于光学显微观察的分辨率不高所致；显性核不育由于是我国特有的甘蓝核不育突变体【5】，并且已经成功应用于甘蓝杂交育种，因此研究得较为深入。继卞春松后，刘玉梅又进一步对显性不育材料通过电子显微镜观察其超微结构，证实其败育高峰在花粉母细胞至小孢子单核期【6】，主要特征是四分小孢子不能分开。本实验对显性不育败育特征的一个重要发现是，其败育的直接原因可能并不是已经发现的包裹四分体的胼胝质壁延迟降解，而是包裹整个四分体的一层在电镜下可清楚观察到的花粉母细胞壁的永久存在(图8N)。这个败育特征和拟南芥雄性不育突变体相似【7,8】，暗示二者可能具有相似的败育分子机理，为我们进一步探明显性不育的分子机理提供了重要线索。3.2 药壁组织与小孢子的协调作用植物雄蕊的发育是二倍体药壁组织(特别是绒毡层)和单倍体小孢子的特定基因精确调控、协同作用的结果【9】。绒毡层是药壁内部紧邻花粉母细胞或小孢子的一层细胞，长期的研究表明，其在花粉形成和发育过程中起关键作用【10】。在许多植物雄性不育材料中均发现绒毡层异常发育【9】，我们的实验表明，隐性核不育和萝卜胞质不育均在早期观察到明显的绒毡层结构和发育的异常，隐性核不育则绒毡层既有提前脱落的特征又有绒毡层延迟解体的特征，萝卜胞质不育则表现最为明显的是其绒毡层细胞异常膨大增生。而显性核不育绒毡层细胞的尽管败育特征不明显，但其最主要的败育特征如胼胝质延迟降解和花粉母细胞壁不能降解，其直接原因推测应该是绒毡层功能异常，可能显性不育绒毡层只是分泌降解胼胝质或花粉母细胞壁的酶的基因功能受阻，但绒毡层细胞结构在形态上差异并不明显。尽管在三种雄性不育类型中，均观察到绒毡层结构异常，但仅以细胞学观察的结果我们难以确定，是小孢子败育刺激了绒毡层的异常发育，还是绒毡层的异常干扰了小孢子的正常发育。4 小结 本实验利用光学显微镜和电子显微镜在细胞水平和亚细胞水平，对三种我国研究和利用较多的甘蓝雄性不育类型进行了较为全面的系统的雄性败育特征和时期分析，以期为进一步阐明甘蓝雄性育性形成的分子机理提供理论依据。实验结果表明：(1) 隐性核不育类型主要败育时期为减数分裂期，主要败育特征为花粉母细胞期绒毡层细胞和中层细胞异常且异常特征在不同植株上表现不一致，四分孢子正常释放后不能形成正常花粉壁并迅速败育。(2) 萝卜胞质不育类型主要败育时期在四分体前期，败育特征主要表现为从减数分裂后期开始绒毡层细胞活动异常,绒毡层细胞进行加厚，其大部分四分孢子能自由释放但受绒毡层细胞挤压败育，其小孢子外壁孢粉素沉积延迟，但最终能发育出较为完全的花粉外壁。但部分中层细胞直至花药开裂仍不能降解，以及花粉壁延迟形成也可能是萝卜胞质不育相关基因导致的重要败育特征。(3) 显性核不育类型主要败育时期在四分体后期，主要败育特征是小孢子不能自由释放但花粉壁能正常沉积孢粉素。(4) 本实验另一个重要发现是，显性不育其败育的直接原因可能并不是已经发现的包裹四分体的胼胝质壁延迟降解，而是包裹整个四分体的一层在电镜下可清楚观察到的花粉母细胞壁的永久存在。附录（一）(节选)BA。DCFE图1 正常可育花药发育过程光学显微观察 A为造孢细胞期；B为小孢子母细胞期；C为四分体时期；D为小孢子释放期 ；E为小孢子成熟期；F为花药开裂期 Nu PW NuBAC ML Ta Nu NuVaFEDEx Nu CaMiIHGExEx NuLKJ图2 正常可育花药发育电镜观察（放大倍数及标尺见图片）Va,液泡; Nu, 核; Ca, 胼胝质壁; Mi, 线粒体; Ex, 花粉外壁; ML,中间层; PW, 花粉母细胞壁; Ta, 绒毡层。白色箭头指示花粉外壁；黑色菱形指示中间层；黑色箭头指示花粉母细胞壁；黑色三角指示绒毡层。A 花粉母细胞发育正常，孢子囊和四层细胞清晰可辨； B 花粉母细胞发育正常, 排列紧密核居中；C 花粉母细胞核膜清楚，细胞核大，核仁大；D 四分体期四分孢子绒毡层结构清晰；E 四分体期绒毡层结构及核清晰，细胞液泡化，有淀粉粒沉积；F 四分孢子核大，外被一层厚厚的胼胝质；G 四分孢子内单个小孢子核大居中，核质、胞质稠密，线粒体丰富；H 单核小孢子时期药壁外层和内层液泡化膨大，绒毡层细胞降解，花粉外壁部分形成；I 单核小孢子核居中，核膜清楚，胞质稠，质体丰富；J 单核晚期形成中心大液泡将核挤向一边，小孢子壁继续增厚；K 二核小孢子，小孢子壁基本形成，中心液泡消失；L 成熟花粉粒形成覆盖层，基粒棒，基底层，外壁内层四层花粉壁； 参考文献1) Scott R.Hodge R, Paul W The molecular biology of anther differentiation. Plant Sci,1991，80:167-1912) Rowley, J. R. Formation of pollen exine bacules and microchannels on a glycocalyx. Grana 1973，13,129-1383) Steiglitz, H. Role of b-1,3-glucanase in postmeiotic microspore release. Dev. Biol. 1977，57,87-974) 卞春松.几份不同遗传类型甘蓝雄性不育花药发育的细胞形态学研究: 硕士论文。北京：中国农业科学院，1994，1-165) 方智远,孙培田,刘玉梅,杨丽梅,王晓武.甘蓝显性雄性不育系的选育及其利用。 园艺学报，1997，24(3)：249-254.6) 刘玉梅.甘蓝显性细胞核雄性不育的细胞学特征、生化基础及其分子标记的研究。中国农业科学院研究生院博士论文, 20037) Preuss, D., Rhee, S. and Davis, R.W. Tetrad analysis possible in Arabidopsis with mutation of the quartet (qrt) genes. Science .1994，264,1458-1460.8) Rhee, S.Y.and Somerville, C.R. Tetrad pollen formation in quartet mutants of Arabidopsis thaliana is associated with persistence of pectic polysaccharides of the pollen mother cell wall. Plant J.1998，15,79-88.9) Raghavan, V.Anther developmental biology. In Molecular Embryology of Flowering Plants, V. Raghavan, ed (Cambridge, UK: Cambridge University Press), 1997，pp.17-60.10) Shivanna, K.R., Cresti, M., and Ciampolini, F.Pollen development and pollen-pistil interaction. In Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement, K.R. Shivanna and V.K. Sawhney,eds (Cambridge, UK: Cambridge University Press), 1997，pp.15-39.致谢 本文是在导师*博士的精心指导下完成的，*老师是中国农业科学院蔬菜花卉研究所的在读博士，*老师在科研工作勤劳、谦逊和务实的作风是我在今后学习和工作的楷模，作毕业设计的这几个月里，他及时了解实验的进展情况，并提出宝贵的建议，为我提供实验所用的药品和器材，使我的论文得以顺利完成，在这里我真诚的向他说一声：谢谢您*老师！ 在此我还要感谢生命科学学院的指导教师*老师，谢谢她在百忙之中抽出时间来修改我的论文，使得文章变得精炼严谨。 我还要感谢蔬菜所生物技术室的*、*两位老师，他们也对本实验提出了宝贵的、建设性的意见和建议。感谢原子能所的*老师， 通过交流，了解了很多关于包埋和切片的技巧，对实验有很大帮助。除此之外，还有生物技术室的其他师哥师姐们，他们为我营造了一个融洽的氛围，平时也给我很多帮助，这里一并感谢。另外还要感谢*老师，谢谢他为我们联系实习单位。文献1：Twelve primer combinations were used for the AFLP fingerprints, and 251 polymorphism bands obtained in this study. The polymorphism rate was relatively low (43.65%) comparing to the results from between cabbage subspecies of Brassica oleracea, which reflected that the head cabbage landraces are very similar in genotypes and have a relatively low diversity level among the genotypes analyzed. PIC has been used in marker comparison studies concerning the analysis of level of polymorphism.In our work, Relatively lower PIC values ( the average was 0.1038) also suggest that B. oleracea L. captatal cultivars represents a genetically low diverse population. The pairwise genetic diversity analysis which showed the much lower genetic distance (0.0409) within cabbage landraces than that between cabbage and outgroup subspecies(0.3358) strongly support the above conclusion as well.The UPGMA dendrogram tree of all accessions showed that Group I in present study is a distinct group of old late-maturing landraces. Most of the landraces from North of China , Russia and Ukraine fall into this group, but the landraces from Northeast and Northwest of China were mingled. This result suggest that landraces from North of China have relatively relationship to that from their East Europe neighbor countries. The misalignment of other Northeast or Northwest geographical originated late-maturing landraces showed a significant implication that these landraces was probably mingle-crossed and evolved after head cabbage being introduce into different part of China. The fairly high gene flow(Nm=1.3009) in population analysis (Table 4)also strongly support this implication. Another important observation of this study was the clustering together of the morphologically contrasting genotypes of landraces from south of China in group II. Unlike the old late-maturing landraces in group I, The morphotypes of the south of china originated landraces in group II are varing from point-head to drum-head or early-maturing to late-maturing, but they did fall into the same group with high genetic similarity. The incongruity between morphological and molecular data may implied that there were no more signifant genetic distance between these main economical traits in cabbage cultivars than geographical origin diversity. The morphological groups analysis showed that the genetic distance of between groups(0.044) was not significantly greater than the average diversity of within early-maturing groups（0.039） and late-maturing groups(0.043). The low gentic distance between the early and late maturing groups implied that most polymorphisms in present study do not contribute to the phenotypic variation, which indicates that only a few genes are involved in causing the clear economical traits. This may also explain why the different morphotypes from South of China and other countries could clustered into group II together. Jinzaosheng(SO-9), Jixinganlan(SO-2) and Beijingzaoshu(SO-8) are the most commonly applicated early-maturing breeding materials in China. In our study, they have high genetic similarity to typical Europe early-type Golden acre(OE-5), Copenhagen Market(OE-4) which also were regarded as the elite foreign breeding materials. This result evidently confirmed the narrow genetic diversity of main cabbage breeding material in previous study by Fang (2000). Late-maturing round and Flat-balled Cabbages are the oldest group of heading cabbages and the earliest planted ecotype in China according to the historical document in China. This type of cabbage have ever been the most popular old cultivars in China and formed many cultivars in different region. With the aim of allocating the different geographical origin populations of this type of cabbage landraces in more defined groups, early-maturing types were excluded for further analysis. The genetic diversities within populations of China were greater than other Countries populations but no significant genetic distance between Northeast, Northwest and South of China populations reflected both in genetic identity or genetic distance analysis. This result revealed that genetic diversity of late-maturing in China had fairly greater genetic diversity for future cabbage breeding programs.One of the most valuable observation of this study was that the Russia and Ukraine population has closer relationships to North China populations and relatively farer relationships to other Europe country and Africa populations. This result based on molecular data confirmed the historical documents record on late-maturing cabbage cultivars which were introduced into china from Russia both from Northeast and Northwest of China. Though some of the historical document extrapolated that late-maturing cabbage may introduced from Hollad or Other west Europe Countries through South of Chinato North of China, here in our study, It was evidently that old late-maturing landraces had much closer relationships to Russia and Ukraine populations than the west Europe countries populations. Even the late-maturing landraces from South of China and East Asia countries had a closer relationships to Russia and Ukraine populations than to west Europe Countries populations. Considering of the fairly large diversity within North of China populations obtained above, we supported the inference of the head cabbage was introduced several times from Europe through Medditerenian sea , Middle Asia area and Russia to different region of North of China and then spread to South of China and East Asia countries.Although the results of this study suggested Africa originated old late-maturing landraces had the farest genetic distance to other countries, We were not able to accurately determine the result because of the only one late maturing landraces that we can collect from Africa try our best. Maybe the occasionally far genetic distance b