基因工程的基本操作程序

1 2基因工程的基本操作程序 2020 4 18 1 基因工程基本操作的四个步骤 1 目的基因的获取 2 基因表达载体的构建 3 将目的基因导入受体细胞 4 目的基因的检测与鉴定 前提 核心 关键 保证 一 目的基因的获取 一 目的基因主要是 编码蛋白质的基因 请举出三个以上的例子 二 获取目的基因的常用方法有哪些 1 从基因文库中获取 2 利用PCR技术扩增 3 人工合成 请阅读P9第一和二两段 也可以是一些具有调控作用的因子 一 目的基因的获取 一 从基因文库中获取目的基因 1 基因文库 概念见P9 2 基因文库的分类 种类 基因组DNA文库 含有一种生物的全部基因 部分基因文库 只包含了一种生物的部分基因 如 cDNA文库 先建立基因文库 再从中筛选 提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶切 一定大小的DNA片段 将DNA片段与载体连接 导入受体菌中储存 基因组文库 3 构建基因文库 1 构建基因组文库 某种生物的单链mRNA 单链互补DNA 双链cDNA片段 导入受体菌中储存 与载体连接 cDNA文库 反 逆 转录酶 DNA聚合酶 2 构建cDNA文库 3 构建基因文库 基因组文库和部分基因组文库 cDNA文库 比较 注意 基因文库中不是直接保管相应基因 而是保存受体菌 菌中含基因 4 从基因文库直接获取目的基因 怎样从基因文库中获取目的基因呢 1 获取目的基因的根据 如 根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性 4 从基因文库直接获取目的基因 2 用DNA探针从基因文库中获取目的基因 不需要模板 但需要知道序列 来构建探针 4 从基因文库直接获取目的基因 2 用DNA探针从基因文库中获取目的基因 不需要模板 但需要知道序列 来构建探针 也可以用PCR方式从基因文库中获取目的基因 为什么要构建基因文库 直接从含目的基因的生物体内提取不行吗 构建基因文库是获取目的基因的方法之一 并不是唯一的方式 如果所需要的目的基因序列已知 就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中 直接获得 也可以通过反转录 用PCR方式从mRNA中获得 不一定要构建基因文库 但如果所需要的目的基因的序列完全不知 或只知道目的基因序列的一段 或想从一种生物体内获得许多基因 或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同 或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同 或者想得到一种生物的全基因组序列 往往就需要构建基因文库 二 利用PCR技术扩增目的基因 二 利用PCR技术扩增目的基因 前提 有一段已知目的基因的核苷酸序列 以便合成引物 原理 利用DNA双链复制原理 过程 变性 退火 延伸三步曲 变性 加热至90 95 双链DNA解链成为单链DNA退火 冷却至55 60 部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸 加热至70 75 在Taq酶作用下 合成互补的新DNA链 注意 双链DNA中 G和C比例越高 DNA变性温度越高 二 利用PCR技术扩增目的基因 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 条件 原理 方式 以 方式扩增 即 n为扩增循环的次数 结果 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 有一段已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 一对引物 耐热的DNA聚合酶 Taq酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 二 利用PCR技术扩增目的基因 过程 a DNA变性 90 95 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 b 退火 复性55 60 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 从引物处延伸 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 利用PCR技术扩增目的基因 2020 4 18 20 33 8分 请回答基因工程方面的有关问题 1 利用PCR技术扩增目的基本因 其原理与细胞内DNA复制类似 如下图所示 图中引物中为单链DNA片段 它是子链合成延伸的基础 汉水丑生的生物同行 超级群大型公益活动 历年高考题PPT版制作 本课件为公益作品 版权所有 不得以任何形式用于商业目的 2012年1月15日 汉水丑生标记 从理论上推测 第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为 在第轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 15 16 三 汉水丑生的生物同行 超级群大型公益活动 历年高考题PPT版制作 本课件为公益作品 版权所有 不得以任何形式用于商业目的 2012年1月15日 汉水丑生标记 模板DNA PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 2 设计引物是PCR技术关键步骤之一 某同学设计的两组引物 只标注了部分碱基序列 都不合理 如下图 请分别说明理由 第一组 引物I和引物II局部发生碱基互补配对而失效 引物I 自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 汉水丑生的生物同行 超级群大型公益活动 历年高考题PPT版制作 本课件为公益作品 版权所有 不得以任何形式用于商业目的 2012年1月15日 汉水丑生标记 汉水丑生的生物同行 超级群大型公益活动 历年高考题PPT版制作 本课件为公益作品 版权所有 不得以任何形式用于商业目的 2012年1月15日 汉水丑生标记 目的基因的mRNA 单链DNA cDNA 双链DNA 即目的基因 反转录 合成 1 反转录法 以目的基因转录成的信使RNA为模板 反转录成互补的单链DNA 然后在酶的作用下合成双链DNA 从而获得所需的基因 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 2 人工化学合成法 三 人工合成目的基因 在DNA合成仪中合成 根据已知的氨基酸序列合成DNA 基因比较小 核苷酸序列已知 二 基因表达载体的构建 基因工程的核心 目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可以遗传给下一代 同时使目的基因能够表达和发挥作用 原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 编码区 能转录 编码蛋白质 非编码区 不编码蛋白质 能调控遗传信息表达 2020 4 18 33 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 内含子 外显子 与RNA聚合酶结合位点 编码区 非编码区 外显子 内含子 能编码蛋白质的序列 不能编码蛋白质的序列 2020 4 18 34 非编码区 非编码区 编码区 RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 终止子 启动子 原核 真核 基因的结构 2020 4 18 35 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质 原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗 连续 不连续 编码区 非编码 2020 4 18 36 2 表达载体的组成启动子终止子目的基因标记基因等 质粒 DNA分子 限制酶处理 一个切口两个黏性末端 两个切口获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 重组质粒 同一种 3 过程 载体与表达载体的区别 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段 表达载体在载体基础上增加了目的基因 启动子 终止子三部分结构 用到的工具酶 既用到限制酶切割载体 又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接 两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子 终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞 必需以表达载体的方式携带进去 注意 1 构建重组质粒时 需用切割含目的基因的DNA和载体 目的是 切割含目的基因的DNA和载体并非只能用同一种限制酶 2 为防止载体与目的基因自身环化 应该怎么做 3 目的基因与载体成功连接的基础是什么 4 目的基因的插入位点不是随机的 目的基因的插入不能破坏载体上自身需要的基因片段 以及其上的标记基因 且插入在启动子和终止子之间 5 受体细胞不同 基因表达载体的构建也会有差异 基因工程载体的构建需要考虑的因素 1 基因的特点 若来自动物的目的基因含有内含子 不能用于转基因植物 若基因产物是糖蛋白 该基因在原核生物中的表达蛋白不具备天然的活性 2 要选择强启动子或组织特异性启动子 3 要有选择标记基因 三 将目的基因导入受体细胞 一 转化 二 方法 将目的基因导入植物细胞 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 Ca2 处理法 目的基因进入 内 并且在受体细胞内维持 和 的过程 受体细胞 稳定 表达 1 将目的基因导入植物细胞的方法 1 农杆菌转化法 农杆菌特点 易感染双子叶植物和裸子植物 对大多数单子叶植物没有感染能力 原理 Ti质粒上的T DNA可以转移到受体细胞 并整合到受体细胞染色体的DNA上 过程 优点 经济 有效 2 基因枪法 3 花粉管通道法 2 将目的基因导入动物细胞 方法 显微注射法 程序 3 将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点 繁殖快 单细胞 遗传物质少 方法 大肠杆菌 四 目的基因的检测与鉴定 检查是否成功 一 检测 1 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记 以此做探针 使探针和转基因生物的基因组杂交 若显示出杂交带 表明染色体已插入染色体DNA中 1 方法 DNA分子杂交 2 过程 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段 将两种生物的DNA分子的单链放在一起 如果这两个单链具有互补的碱基序列 那么 互补的碱基序列就会结合在一起 形成杂合双链区 在没有互补碱基序列的部位 仍然是两条游离的单链 归纳步骤 二 鉴定 个体生物学水平 2 检测目的基因是否转录出了mRNA 3 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 方法 分子杂交 方法 抗原抗体杂交 过程 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交 若出现杂交带 表明目的基因转录出了mRNA 思考与探究 1 作为基因工程表达载体 只需含有目的基因就可以完成任务吗 为什么 不可以 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用 还需要有其他控制元件 如启动子 终止子和标记基因等 必须构建上述元件的主要理由是 1 生物之间进行基因交流 只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达 2 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子 只将编码序列导入受体生物中无法转录 2020 4 18 53 3 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记 4 为了增强目的基因的表达水平 往往还要增加一些其他调控元件 如增强子等 5 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位 往往要加上可以标识存在部位的基因 或做成目的基因与标识基因的融合基因 如绿色荧光蛋白基因等 2020 4 18 54 思考与探究2 根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理 你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗 若将一个抗病基因导入小麦中 理论上讲你应该怎样做 要选择合适的农杆菌菌株 因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物 要加趋化和诱导的物质 一般为乙酰丁香酮等 目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢 趋化性 和激活农杆菌的Vir区 诱导 的基因 使T DNA转移并插入到染色体DNA上 2020 4 18 55 3 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素 联系前面有关细胞器功能的知识 结合基因工程操作程序的基本思路 思考一下 若要生产人的糖蛋白 可以用大肠杆菌吗 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链 这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的 内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中 大肠杆菌不存在这两种细胞器 因此 在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的 思考与探究 2020 4 18 56 4 珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分 当它的成分异常时 动物有可能患某种疾病 如镰刀形细胞贫血症 假如让你用基因工程的方法 使大肠杆菌生产出鼠的 珠蛋白 想一想 应如何进行设计 2020 4 18 57 1 从小鼠中克隆出 珠蛋白基因的编码序列 cDNA 2 将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子 另外加上抗四环素的基因 构建成一个表达载体 3 将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中 然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌 如果表达载体未进入大肠杆菌中 大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉 如果培养基上长出大肠杆菌菌落 则表明 珠蛋白基因已进入其