秸秆腐蚀剂实验方案.doc

秸秆腐熟剂的设计方案秸秆腐蚀剂应该包括纤维素降解菌、木质素降解菌以及其它辅助菌。本试验方案就是紧紧围绕获得这三类高效菌以及作为一个整体具有良好应用价值的目的而设计的。1高效纤维素降解菌1.1高效绿色木霉的筛选1.11试验材料：武汉合缘生物公司提供的绿色木霉样品1.12培养基l 分离培养基：察氏培养基 硝酸钠 3g 磷酸氢二钾 1g 七水硫酸镁 0.5g 氯化钾 0.5 硫酸亚铁 0.01g 蔗糖 30g 琼脂 20g 链霉素终浓度25g/ml 蒸馏水 1000mll 种子液培养基：200g马铃薯洗净去皮，切成小块，加l000ml水沸水煮lh，双层纱布过滤得到马铃薯汁，加2%葡萄糖，调节pH值至6.8，121、20min灭菌备用l 液体发酵培养基：蛋白陈0.3%，硫酸铵0.2%，酵母膏0.05%，KH2PO4 0.4%，Cacl.2H2O 0.03%，MgSO4.7H2O 0.03%，TWeen-80 0.02%为基础培养基，添加1.5%的稻草粉即为发酵培养基，121、20mni灭菌备用1.13试验步骤1.131利用分离培养基对绿色木霉样品进行初步的筛选，得到绿色木霉单菌落，挑取生长良好的菌落进行复选，这样得到的微生物不含有其它的杂菌1.132将上步得到的菌株接种于种子液培养基中1.133内切-葡聚糖苷酶测定。利用纤维素酶能够水解纤维素产生葡萄糖，以羧甲基纤维素钠为纤维素酶的作用底物，用还原糖的生成量表征内切-葡聚糖苷酶活力，俗称CMC-Nase或CMC-Na酶活力。具体操作如下:l 磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液配制:根据所需缓冲液的不同pH要求，用0.2mol/L的磷酸氢二钠和0.1mol/L柠檬酸配制而成l CMC-Na溶液的配制:称取CMC-Na(羧甲基纤维素钠)1g，加入100mL水，水浴加热结合磁力搅拌使溶解，再加入pH5.0的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液20mL，水40mL搅匀，浓度为0.00625g/ml。l 内切-葡聚糖苷酶活力的测定:取0.5mL稀释一定倍数的酶液，加入l.5mL配制好的CMC-Na溶液，于50保温30min，而后加入2mL10%氢氧化钠溶液终止反应，再加入3mLDNS试剂，沸水浴15min，自然冷却后在550nm处测定样品的吸光度。样品的参比液为:同一酶液先加入2mL10%氢氧化钠将酶灭活，然后再加入底物，其余操作同上。l 运用回归分析法，得到酶活力大小。具体如下：将测量得到的数据代入由标准曲线测量值计算出的回归方程，再由回归方程计算出相应的被测样品所含还原糖量，根据酶活力单位定义计算出酶活力大小。1.134外切-葡聚糖苷酶活力的测定用pH5.0的Na2HPO4一柠檬酸缓冲液配制浓度为1g/100ml的微晶纤维素溶液，取该溶液0.5ml并加入0.5ml酶液，30震荡(200r/min)20h，其它同内切-葡聚糖酶活力的测定。1.135若上步酶活太低，可以再从野外采样，筛选酶活高的菌株1.136若获得菌株仍不理想，可以诱变菌株l 绿色木霉斜面复活紫外线诱变恒温暗培养挑选菌落接种斜面初筛摇床发酵酶活力测定筛选出一株酶活力较高的菌株(诱变菌株)l UV+亚硝酸钠诱变恒温培养挑选菌落接种斜面摇床发酵酶活力测定选出一株酶活力较高的菌株(复合诱变菌株)l UV+NaNO2+硫酸二乙酯诱变恒温培养挑选菌落接种斜面选出的菌株和诱变菌株比较传代实验选取稳定的变异菌株保种传代实验选取稳定的变异菌株保种1.2高效黑曲霉的筛选1.21试验材料：武汉合缘生物公司提供的黑曲霉样品1.22培养基（同1.12）1.23试验步骤1.231（同1.131）1.232（同1.132）1.233-葡萄糖苷酶活力的测定用pH5.0的Na2HPO4一柠檬酸缓冲液配制浓度为1g/100ml的水杨素溶液，取该溶液1.0ml并加入1.0ml酶液，50反应30min，其它同内切-葡聚糖苷酶活力的测定。1.235（同1.135）1.236（1.236）2高效木质素降解菌2.1材料来源：野外采样2.2培养基l PDA 综合培养基:马铃薯提取液1 000 ml 、葡萄糖20 g、KH2 PO4 3. 0 g、MgSO4 H2O 1. 5 g、维生素B1 微量、琼脂15. 0 g。l 选择性培养基:俞创木酚1. 0 g ,酒石酸铵0. 1 g ,蛋白胨2. 6 g ,MgSO47H2O 0. 5 g ,KH2 PO4 1. 0 g ,Na2HPO4 0. 2 g ,琼脂18 g ,加蒸馏水至1 000 ml 。l PDA Bavendamm 培养基:在PDA 培养基中加入鞣酸至终浓度为0. 01/ 100ml 。l PDA RB 亮蓝培养基:将RB 亮蓝单独灭菌后按625g/ ml 的浓度加入到PDA 培养基中,混匀。2.3试验步骤2.31确定5 个采样点,采集深层土壤样品,用无菌水稀释为不同浓度的土壤悬浮液,结合涂布法,在PDA 综合培养基上通过不断的划线分离直至获得纯菌种,于PDA 斜面培养基上保种。2.32菌种初筛将分离所得的菌种划线接种到选择性培养基上,观察菌种变色圈的形成,挑选变色圈在菌丝外围形成的菌种。2.33菌种复筛复筛的目的是通过变色反应,筛选出产生木质素降解酶(过氧化物酶、漆酶) 能力较强的菌株。将经初筛的菌株接种于PDA Bavendamm 平板上,30 条件下培养10 d ,每天观察变色圈的形成情况并记录显色时间,如能产生棕褐色轮环则为阳性反应( + ) ,反之则为阴性反应( - ) ,选择显色快、变色圈直径大的菌株接种于PDA-RB 平板上,30 条件下培养10 d ,观察菌落周围有无脱色圈产生,产生者记为“+ ”,反之记为“ - ”。2.34秸秆降解试验称取10 g 秸秆粉于250 ml 三角瓶中,加入12 ml 合成培养液,培养液配制:培养液体积比为酒石酸铵液1 、大量元素液15 、微量元素液15 、VB1 液3 、水16 。120 高温灭菌20 min ,备用。其中酒石酸铵(22. 0 g/ L) 为氮源,大量元素液每升含20 g KH2 PO4 、13. 8 g MgSO4 7H2O、1. 0 g CaCl2 和0. 6 gNaCl ,微量元素液每升含0. 35 g MnSO4H2O、60 mg FeSO47H2O、110 mg CoCl2 6H2O、60 mg ZnSO4 7H2O、95 mgCuSO45H2O、6 mg AlK(SO4 ) 212H2O、6 mg H3BO3 和6 mgNa2MoO42H2O ,VB1 的质量分数为100 mg/ L 。菌株接种于PDA 综合培养基上活化,用接种针剥取适量孢子,加入无菌水中制成孢子悬液(1. 0 105 ) ,吸取摇匀的菌丝悬浮液5 ml ,加入灭菌的秸秆粉培养基中,30 恒温静置培养15 d ,每个菌株设三个重复。经15 d 培养后的秸秆培养基于65 烘干48 h ,测定样品中木质素的含量并计算木质素降解率。木质素含量测定方法采用范氏(Van Soest ) 纤维测定法。木质素降解率计算公式:木质素降解率( %) =(秸秆初始木质素含量- 样品木质素含量) / 秸秆初始木质素含量100 。2.35挑选木质素降解率高菌株保存3应用试验3.1试验菌种上步试验中得到的三株菌以及实验室保存的酵母3.2秸秆的原料及处理1.31农作物秸秆稻草、玉米、小麦和豆秆。1.32发酵液配方秸秆粉70%、麸皮30%、硫酸铵3%、尿素1%和水份68%。1.33秸秆的处理把农作物秸秆（稻草、玉米秸秆、小麦和豆秆都可）剪成1寸长的小节晒干，粉碎后40目过筛。然后每一种农作物秸秆的粉末按发酵培养基的要求配成发酵液，装入250mL三角瓶中高压灭菌。1.34发酵液接种按秸秆发酵培养配方组合要求配置好各种秸秆的发酵液以后，经过高温121灭菌半个小时后，按组合的要求（如下表）接种相应的微生物，接种后的三角瓶放在28的培养箱中摇床培养15天，每2d-3d测下每个组合的发酵产物。分别对产物进行如下处理：称取固态发酵产物5g，用40mL75%乙醇浸提24，充分搅拌、抽滤，滤渣再用40mL75%乙醇反复洗涤2次，除去无机氮和尿素。处理后的发酵基质烘干后分装有