致病菌生态研究在致病菌筛选中应用

致病菌的生态研究在致病菌筛选中的应用 微生物检验用培养基历史 最初从水中大肠菌群开始 19世纪后半叶 食品微生物 包括饮用水 检验历史有100多年 后来逐渐研究出许多培养基 使用的抑制剂有胆盐类 染料类 如煌绿 结晶紫 品红 美兰等等 无机盐类 如氯化钠 叠氮化钠 氯化锂 亚硒酸盐 亚硫酸盐类等 甘氨酸等氨基酸类 醋酸钠等有机酸类等等 后来 使用抗生素越来越多 选择性逐渐提高 但使用起来不太方便 初期由于培养基都是国外研究出的 因此我们不易看到原始资料和基础数据 而我国自己研究出的检验用培养基数量有限 当前情况 系统研究少 没有形成真正意义上的系统的检验理论体系 造成大学里目前没有合适教材讲解食品卫生微生物检验学的传统方法部分 推荐有关书籍 当然由于目前技术水平的限制 现代检测部分也不够完善 大学教材与实际工作结合的不是很理想 传统检验方法目前存在的问题 选择系统不够精确 如肠杆菌科某一属的精确筛选达不到 显色培养基是目前选择性培养基发展的主要方向 达到快速检验的目的 总之 不管使用的选择剂有怎样变化 有一点不变 那就是选择性培养基要符合目的菌生长的特殊的生态要求 这些生态要求可以归纳为不同的生态因子 推荐书目TheMicrobiologicalSaftyandQualityofFoodBarbarM Lundetal2001HandbookofculturemediaforFoodMicrobiologyJ E L Corryetal2002 微生物生长有关的生态因子 温度营养成分水分活度氧气及其他气体酸碱度 渗透压氧化还原电位抑菌物质其他生命体其他 温度 按照不同细菌的生长温度范围食品中的细菌可分为嗜冷细菌 冷营细菌 嗜中温细菌 嗜热细菌 在空肠弯曲菌检验中使用42 培养 可抑制其他不耐热的弯曲菌和部分弓形杆菌 鲜肉在不同温度放置以后 普通变形杆菌 奇异变形杆菌 摩根氏菌摩根菌和碱化普罗威登氏菌均出现生长 如果放置10 以下主要出现碱化普罗威登氏菌 猪肉保存过程中菌相的变化 佐藤善博金子精一1986 菌落数30 培养4日35 培养2日保存时间02日3日5日7日02日3日5日7日假单胞菌1932383433117641不动杆菌3200022000莫拉氏菌0010010000黄杆菌3000061000弧菌1100021210气单胞菌000002171070肠杆菌科201121010202839微球菌4100011100链球菌0001000000乳杆菌0003300000棒杆菌3201031000微杆菌0000200000芽孢杆菌1100000100酵母4100020000合计 菌落数 40404040404040404040注 菌落数为4个猪肉保存样的平均值 细菌鉴定时从平板中挑出任意10个菌落 4个样共40个菌落 进行纯培养后进行鉴定 温度对菌相确定的影响 有人用5 保存猪肉7日 按不同保存时间 0 2 3 5 7日分别取样 后分别以两个温度 30 培养4日35 培养2日 和培养以调查菌相 30 培养时以菌相以假单胞菌为主 5 保存保存2日时假单胞菌占80 以上 35 培养时以肠杆菌科为主 5 保存2 5日时期气单胞菌的比例上升 因此判断菌相时 要考虑温度等培养条件的干扰因素 营养成分 水碳源氮源硫源磷源矿物质生长因子 有的致病菌生长需要特殊的营养 因此要满足其特殊的营养要求 如大多数金黄色葡萄球菌为脯氨酸缺陷型 使用酸水解的蛋白胨 可能分离不到样品中存在的金黄色葡萄球菌 受伤菌特殊营养要求 受伤菌的恢复生长 常常需要丰富的营养 但在培养饥饿状态的受伤细菌 如水中的和海水中的受伤菌时低营养反而有利 检验用稀释液一般使用蛋白胨水 并添加触酶 镁离子 丙酮酸 铁离子等 稀释液的成分有时是很关键的 0 1 的蛋白胨水对冷冻受伤的大肠杆菌活菌回复率高 有的细菌生长需要脂肪酸 油酸以吐温80的形式加入 志贺氏菌增菌液中使用吐温80利于受伤菌的修复 小肠结肠炎耶尔森氏菌培养中添加吐温80刺激其生长 营养成分的比例有选择性 明串珠菌 腌制朝鲜泡菜时 如果蔗糖添加过量 就容易长明串珠菌 蛋白质含量高时容易生长变形杆菌族等蛋白分解力强的细菌 水分活度 微生物生长需要的最低水分活度为 一般细菌0 91 一般酵母0 88 一般霉菌0 80 嗜盐菌0 75 耐渗菌0 60 大肠杆菌 沙门氏菌生长需要的最低水分活度为0 93 产气荚膜梭菌 蜡样芽孢杆菌为0 91 金黄色葡萄球菌为0 86 肉毒梭菌A和B型 副溶血性弧菌 单核细胞增生李斯特菌为0 94 肉毒梭菌E型为0 975 空肠弯曲菌 小肠耶尔森氏菌为0 98 在婴儿米粉等粉状食品中有时能够分离到金黄色葡萄球菌 可能就是在这种低水分活度的食品中也能缓慢生长而成为优势菌 氧气等气体 根据生长需氧 把细菌分成专性好氧菌 厌氧菌 兼性厌氧菌 微需氧菌和耐氧菌 个别细菌 如布鲁氏菌 生长需要提供5 10 的CO2 否则不生长 5 的CO2促进乳杆菌属的生长 1 或更低浓度的CO2刺激需氧菌对O2的吸收利用 但大多数细菌生长被高浓度CO2 5 50 抑制 甚至被杀灭 高浓度CO2不抑制沙门氏菌和产气荚膜梭菌 但抑制金黄色葡萄球菌 假单胞菌对二氧化碳最敏感 乳酸菌和梭菌不敏感 变形杆菌耐CO2 而芽孢杆菌 肠杆菌 黄杆菌 微球菌不耐CO2 酸碱度 嗜酸醋杆菌2 8 4 3枯草杆菌4 5 8 5粪产碱菌6 4 9 7嗜热脂肪芽孢杆菌5 2 9 2大肠杆菌4 4 9 0肉毒梭状芽孢杆菌4 7 8 5肺炎克雷伯氏菌4 4 9 0生孢梭菌5 0 9 0普通变形杆菌4 4 9 2双歧双歧杆菌3 8 7 2粘质沙雷氏菌4 0 9 0碱性胨水为增菌液分离副溶血性弧菌 铜绿假单胞菌5 6 8 0微球菌5 6 8 1副伤寒沙门氏菌4 5 7 8金黄色葡萄球菌4 0 9 8伤寒沙门氏菌4 0 4 5 8 0 9 6乳酸链球菌4 3 4 8 9 2副溶血性弧菌4 8 11酿脓链球菌6 35 9 2蜡样芽孢杆菌4 9 9 3屎肠球菌4 4 4 7 9 2乳杆菌3 8 4 4 7 2 应用举例 碱性胨水为增菌液分离副溶血性弧菌 MM增菌液就是利用酸性条件筛选沙门氏菌 小肠耶尔森氏菌通过胃时能耐胃酸是靠分解尿素来实现的 小肠耶尔森氏菌在短时间内比其他肠道杆菌更耐碱 在该菌的分离中使用碱杀死增菌液中杂菌 在样品中假单胞菌多时 碱杀菌效果明显 另外 革兰氏阴性杆菌比革兰氏阳性杆菌对碱更敏感 渗透压 不同细菌耐不同大小的渗透压 副溶血性弧菌在10 以下氯化钠浓度中可生长 2 3 浓度中生长最好 肠球菌可在2 4 氯化钠浓度中生长 有的甚至可在大于6 5 的氯化钠浓度中生长 金黄色葡萄球菌可在10 15 氯化钠浓度中生长 甚至在18 氯化钠浓度中生长 空肠弯曲菌则在0 5 的氯化钠浓度中生长最好 氯化钠浓度在3 5 以上时 除沙雷氏菌外大多数肠杆菌科菌一般生长不良 不只是氯化钠 很多化学物质都产生渗透压 液体培养基都会形成渗透压 细菌在一定渗透压的环境中 为适应这种压力 不断从环境中吸收相容性溶质 这被认为是细菌生长的动力 相容性与不相容性 相容性溶质 compatablesolute 为达到渗透压平衡 细胞不断积累非离子的或高水活性的即时在很高浓度下也不影响其代谢的物质 所谓不相容性是指某些分子或离子在细胞内的积累会影响细胞及其组分特别是生物大分子的正常结构和功能 原因是各种中性盐对蛋白质和胶体的结构和溶解度不同 不同的阴 阳离子会引起生物大分子不同级别的构象变化 体外试验表明钠离子严重抑制大肠杆菌 枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的醛醇酶 异柠檬酸脱氢酶和磷酸己糖异构酶 Osmolyte Osmolyte 为达到并平衡细胞内外的渗透压而积累于细胞内的有机或无机溶质 两个来源 外源的和自身合成的 不同细菌具有不同的抗高渗的机制 一般是在细胞内积累合适的溶质 如钾离子 谷氨酸 谷氨酰胺 脯氨酸 丙氨酸 氨基丁酸 甜菜碱 蔗糖 海藻糖 葡萄糖 甘油 1 4 5 6 四氢 2 甲基 4 嘧啶羧酸 Ectoine 四氢嘧啶 等 其中甜菜碱 脯氨酸 Ectoine和海藻糖被认为最重要 细菌在不同渗透压下使用不同的Osmolyte 几种重要的Osmolyte 利用渗透压筛选致病菌的应用 金黄色葡萄球菌的筛选 用甘露醇高盐琼脂 7 5 盐肉汤等 沙门氏菌的筛选 氯化镁孔雀石绿 MM 来筛选 这里分别用氯化钠 氯化镁和其他成分制造高渗透压 然后用蛋白胨中的成分来解高渗透压 脯氨酸 甘氨酸 谷氨酸 金葡 甜菜碱 谷氨酸钾及其他物质 沙门氏菌 沙门氏菌选择性增菌液的选择作用 M A Morinigo等1993 培养基及培养温度TB 43 SC 36 RV 43 菌名24h48h24h48h48h白色念珠菌CECT1349 巨大芽孢杆菌CECT44 藤黄微球菌CECT244 金黄色葡萄球菌CECT232 弗隆迪柠檬酸杆菌CECT401 产气肠杆菌CECT400 大肠杆菌CECT102 肺炎克雷伯氏菌CECT143 奇异变形杆菌CECT170 绿脓杆菌CECT108 粘质沙雷氏菌CECT137 沙门氏菌UM100 肠炎沙门氏菌UM497 副伤寒沙门氏菌CECT504 伤寒沙门氏菌CECT409 鼠伤寒沙门氏菌CECT159 注 最适生长 中等生长 低生长 不生长TB 四硫磺酸盐培养基SC 亚硒酸盐胱氨酸培养基RV 氯化镁孔雀绿培养基 以海水和淡水样品测试 氧化还原电位 食品中的微生物区系处于一个动态变化之中 有人总结了肉等蛋白质含量高的食品中的细菌变化规律 水系杆菌 低温细菌 肠杆菌科细菌 乳酸菌 普通球菌 产芽孢菌 其中水系杆菌指有些假单胞菌 产碱菌 黄杆菌等 这一变化的部分原因在于氧化还原电位的变化 在培养基中加入还原剂硫酸亚铁0 25mg ml 次亚硫酸钠 Sodiummetabisulfite 0 25mg ml和丙酮酸钠0 25mg ml时 不需要微需氧特殊气体环境 因为此时氧气已经不能伤害空肠弯曲菌 抑菌物质 自然界中的抑菌物质 氨基酸类 常用的有甘氨酸 需要较高浓度 其他有抗菌作用的氨基酸有丙氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 苯丙氨酸 胱氨酸 精氨酸等 因经济原因只使用甘氨酸 当然不同氨基酸对细菌的选择性也不同 有机酸类 如柠檬酸 低浓度下抑制革兰氏阳性球菌类 0 1 抑制微球菌属和葡萄球菌属 高浓度下抑制革兰氏阴性杆菌 0 5 以上抑制肠杆菌科细菌和芽孢杆菌及霉菌 酵母 0 5 的浓度用于筛选乳酸菌 pH6 0以下时有抑菌效果 脂肪酸类 如壬二酸抑制丙酸杆菌和葡萄球菌 还抑制部分真菌 胆盐类各种抗生素及其他许许多多尚不知道的物质 甘氨酸的抗菌性 驹形和男等1968 选取部分 甘氨酸浓度0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 5 10 细菌枯草杆菌 大肠杆菌 铜绿假单胞菌 腐臭假单胞菌 锈色假杆菌 黄杆菌 无色杆菌 似产碱产碱菌 微黄短杆菌 产氨棒杆菌 肿大地杆菌 藤黄八叠球菌 金葡菌 微生物检验中常用的抑菌物质 可分为以下几类 无机盐类 氨基酸类 有机醇类 有机酸及其衍生物 表面活性剂类 染料类 抗生素类 二氧化碳等 二氧化碳 在沙门氏菌检验中使用TTB增菌液 其中有碳酸钙 除起缓冲作用外 还提供二氧化碳 具有选择作用 其他生命体抑制生长 乳酸链球菌产生尼生素 抑制革兰氏阴性菌的生长 枯草杆菌产生杆菌肽 能抑制许多革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌 多粘芽孢杆菌产生多粘菌素 能杀死大部分革兰氏阴性菌的生长 粘质沙雷氏菌产生灵红菌素抑制大肠杆菌 产气肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 绿脓杆菌等 短杆菌属产生脂肪酸抑制肉毒杆菌 乳杆菌属产生过氧化氢 抑制假单胞菌属 芽孢杆菌属和变形杆菌属的一些种 肠道中的某些厌氧菌产生脂肪酸抑制沙门氏菌在局部生存 其他生命体刺激生长 以酪蛋白为唯一氮源时 莓实假单胞菌和蜡样芽孢杆菌刺激单核细胞增生李斯特菌生长 这是由于前二种菌向细胞外分泌蛋白酶 分解酪蛋白产生短肽被李斯特菌利用的结果 有时不同的细菌协同作用完成基质的转化 如金黄色葡萄球菌和普通变形杆菌都不能单独利用乳糖 但二者在一起时就能利用乳糖 大肠菌群检验中可能碰到的情况是 在液体培养基中单独培养时不能产气的两种细菌 共同培养时 就可能产气 BP增菌液中肠杆菌科之间相互作用 Jameson曾以缓冲蛋白胨水为增菌液 BP 对肠杆菌科的不同种之间的相互作用进行过研究 发现在沙门氏菌前增菌液BP中 不同肠杆菌科细菌之间没有拮抗作用 并且单独培养时 对数期和繁殖代数非常相似 混合培养时优势菌达到稳定期后会抑制其他肠杆菌科细菌的生长 使之过早进入稳定期 Jameson效应 不管数量少的菌进入哪一期 Jameson称之为增菌初期 继续培养时数量少的肠杆菌科细菌就会生长 但比初期生长缓慢 要达到稳定期需要更长时间 使用不同大肠杆菌和沙门氏菌试验发现 同一种不同菌株之间也有这种Jameson效应 试验表明优势菌的形成及形成的快慢 取决于其起始浓度和竞争者的存在 与肠杆菌科的菌种和菌株无关 结果沙门氏菌不是优势菌时 其检出与否与增菌时间关系密切 BP也可用于其他肠杆菌的前增菌 研究方法 由此可见致病菌的生态学研究在致病菌选择中的重要性 研究方法模拟自然环境 寻找环境中关键生态因子与所出现的致病菌的对应关系 如胆盐的利用与肠道细菌的筛选 利用不同生态因子 改变同一生态因子的不同参数或不同化学成分进行试验 找出最适合目的菌生长的参数和化学物质 不同生态环境中生长着与其生态环境相对应的不同生命体 土壤中生长大量蜡样芽胞杆菌 食物保存时间过长时容易生长乳酸菌等 温血动物肠道中生长着肠杆菌科细菌和许多种厌氧菌 在动物肠道 食物 由胆汁等各种消化液成分 不同比例的氮气 氧气 二氧化碳 氢气 甲烷 肠道中的其他细菌等给不同肠道菌提供不同的生态条件 因此在不同的肠段生长不同的优势菌种 如空肠弯曲菌生活于空肠和回肠 不同的致泻性大肠杆菌或结病灶于小肠 EPEC ETEC DAEC 或结病灶于结肠 EIEC STEC 利用 一种细菌或某一类细菌在自然界中生长有其特殊的生态环境 如果我们提供完全适合特定目的菌生长的生态环境 就比较容易分离到目的菌 微生物检验中使用的各种培养条件和培养基就是在提供特殊的生态环境 特殊生态条件的研究 不同致病菌和不同细菌菌群的特殊生态 沙门氏菌 沙门氏菌与肉关系密切 其次为蛋和乳 马在经受刺激时 坐船 麻醉 驱虫药 外科手术 抗生素 强的松等 易感染沙门氏菌病 幼鸡的嗉囊中未形成乳酸菌时易感染沙门氏菌病 沙门氏菌的感染似乎与肌肉中某种化学成分的出现有关 可疑因子 胆碱 镁离子 肌肽 血液成分等等 金黄色葡萄球菌 葡萄球菌源于人和动物 容易出现于含高淀粉的干燥的高营养食品 具有在低水分活度下生长的本领 普通细菌生长需要的最低水分活度为0 91 而金黄色葡萄球菌为0 86 金黄色葡萄球菌多为脯氨酸缺陷型 在含高浓度氯化钠溶液中也需要通过细胞内积累脯氨酸解高渗环境 埃希氏菌 据调查 某抗生素厂排出的废水中有大肠埃希氏菌 费氏埃希氏菌 中间埃希氏菌 淡黄假单胞菌 卵状假单胞菌 缓慢假单胞菌 莓实假单胞菌 粪产碱菌 放线菌 诺卡氏菌 蜡样芽孢杆菌 迟缓芽孢杆菌 生枝动胶菌 无色杆菌 节杆菌 黄杆菌等 分析菌相会发现埃希氏菌与需氧菌在一起生活 而其他肠杆菌科细菌很少出现 说明这些埃希氏菌属细菌的生长有与其他肠杆菌科细菌不同的生态要求 在志贺氏菌增菌液中使用厌氧培养 此时志贺氏菌就能够与大肠杆菌竞争 结论 大肠杆菌 有人对天然牛黄和牛活体胆汁中的菌群进行了研究 发现天然牛黄及产牛黄的牛活体胆汁中都有细菌存在 而且都是大肠杆菌 但同一产牛黄的胆囊中有的存在数种血清型和不同生化特性的大肠杆菌 而正常牛胆汁中 56 8 的牛存在细菌 其中80 9 为大肠杆菌 还有其他细菌 说明产牛黄的胆汁对大肠杆菌有专一的选择性 有研究结果表明 成黄胆汁与正常牛胆汁比较 胆红素和钙 钠含量显著增加 胆固醇含量也显著增加 志贺氏菌 志贺氏菌等通过人的手指传播 流行病学调查显示 在志贺氏菌流行季节可以从病人相关的门把手 椅子 床单 儿童玩具 衣服等地方分出志贺氏菌 汗液可能是粪便外的另一种致病菌传播媒介物 证据之一是大肠杆菌O157 H7 霍乱 伤寒 副伤寒的流行似乎也与正常汗液成分的变化有关 小肠结肠炎耶尔森氏菌 猪是小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要携带者 多栖息于猪的咽喉 可能与猪的喊叫造成细胞膜破裂有关 引起食物中毒的食品为含猪肉食品 巧克力 豆腐等 随冷藏肉和沙拉的普及而流行 这样看来 脂肪成分可能是小肠结肠炎耶尔森氏菌生长的关键 吐温80刺激其生长 说明了脂肪酸对于小肠结肠炎耶尔森氏菌生长的重要性 李斯特菌 李斯特菌在青贮饲料中容易出现 因此李斯特菌病也叫青贮饲料病 是由于青草发酵不正常造成的 另外在羊群中李斯特菌的携带率最高 上世纪80年代以来 在西方与李斯特菌有关的食物中毒越来越突出 可能与食品中经常使用添加剂 如蛋白粉 甘氨酸等 有关系 因为这样做改变了原来食品的微生物生态环境 李斯特菌可能利用甘氨酸 或肽类物质适应高渗环境成为优势菌 副溶血性弧菌 目前有的沿海城市副溶血性弧菌食物中毒占细菌性食物中毒的第一位 副溶血性弧菌是生长于海水和海泥中的细菌 当海水温度大于20 时爆发性增值 污染鱼贝类 这种菌生长很快 每10分钟分裂一次 鱼贝类的副溶血性弧菌污染过程研究中 汽水域 越来越受到关注 所谓 汽水域 指河水进入海口处和涨潮时海水倒入河水处 这种地方盐分比海水少 盐水浓度发生变化 这种菌在汽水域和盐分低的泥土及海底泥土中过冬 到夏天海水温度升高后爆发生长由汽水域扩散到沿岸海水中 空肠弯曲菌 通过食物进入人体的弯曲菌属有四种 空肠弯曲菌 大肠弯曲菌 红嘴鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌 由于在42 培养时生长者多为空肠弯曲菌和大肠弯曲菌 也叫结肠弯曲菌 因此也叫耐热弯曲菌 从其生活的生态来看与胆汁和肠液关系密切 除动物胆汁中发现有弯曲菌外 沾有胆汁的肝脏中也发现有弯曲菌 鸡直肠中约90 为阳性 鸟类的盲肠部分弯曲菌含量最高 在屠宰车间要求结扎胆管和肠管 以减少空肠弯曲菌的污染 利用致病菌特殊生态条件研究筛选致病菌的培养基 我们可以从致病菌感染的生态出发 研究致病菌最关键的生长条件 来找到分离致病菌的方法 对培养基研究可能有借鉴意义的肠道生态研究皮肤粘膜生态研究口腔生态研究病灶特殊生态研究 皮肤生态 皮肤的正常菌群为凝固酶阴性的葡萄球菌 微球菌 棒杆菌 短杆菌等 当汗液成分发生变化时生长一些过路菌 如金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 绿脓杆菌 变形杆菌 粪产碱菌 不动杆菌 丙酸杆菌等 不动杆菌在汗液增加时明显增多 汗液成分变化的研究可能对致病菌的筛选方法研究有帮助 通过接触传播的致病菌的营养要求可能与汗液成分有关 汗液及口腔生态 不同人的汗液成分是不同的 而且同一个人在不同的时期随食物和运动情况汗液成分也不一样 汗液