DNA甲基化检测ppt课件

DNA甲基化的检测方法 1 DNA甲基化检测的基本原理 目前文献报道的各种DNA甲基化分析方法均依赖于三种基本原理 它们分别是 甲基化敏感性限制性核酸内切酶 MSRE 分析方法对DNA中的胞嘧啶进行化学修饰的重亚硫酸盐转化用甲基CpG结合蛋白分离甲基化的DNA 1 1甲基化敏感性限制性核酸内切酶分析方法 此类方法主要是利用部分甲基化敏感性限制性核酸内切酶 MRSE 所识别的DNA序列如果被甲基化则不能切割这一序列 利用这一特性 对基因组DNA进行酶切后 再采用一些方法对酶切后基因组DNA进行检测 即可明确所检测位点的甲基化状态 1 2对DNA中的胞嘧啶进行化学修饰的重亚硫酸盐转化 在DNA单链中 未甲基化的胞嘧啶在高浓度的重亚硫酸盐作用下经一系列化学反应后可转化成尿嘧啶 U 而5mC则保持不变 在随后的PCR过程中 尿嘧啶 U 被转换为胸腺嘧啶 T 如此就将胞嘧啶的甲基化修饰这种化学修饰信息转化为序列差异信息 1 3 用甲基CpG结合蛋白分离甲基化的DNA 利用甲基CpG结合蛋白 MeCP 可以结合DNA中的甲基CpG的性质 以MeCP为填充物开发的MBD柱层析法可将基因组范围内的甲基化DNA片段分离出来 再结合前两种原理可对全基因组范围内的甲基化位点进行扫描 2 DNA甲基化检测的方法 基于以上的每一种原理均可开发出多种方法 每种方法都有其优缺点及适用范围 常用方法有 甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩增 MS MLPA 甲基化特异性PCR MSP 重亚硫酸盐测序 2 1甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩增 MS MLPA 这是一种基于MSRE的分析方法 该方法要求所检测的CpG位点位于某一特定的MSRE识别序列内 如Hha 所识别的GCGC 针对该位点设计两条探针 上游探针的3 端位于该位点5 端1个碱基处 下游探针5 端位于该位点3 端1个碱基处 上游探针的5 端和下游探针的3 端含有一套公用PCR引物序列 针对不同位点的探针长度可有不同 将探针与模板DNA杂交后 加入连接酶进行连接反应 并加入相应的MSRE如Hha 若该位点甲基化 Hha 不能切割 则模板保持完整 随后的PCR反应可以进行 若未甲基化 Hha 将连接反应形成的模板DNA切割 随后的PCR反应不能进行 2 2甲基化特异性PCR MSP 基本原理是当用化学试剂重亚硫酸盐处理样品时 所有未被甲基化的胞嘧啶C将发生脱氨基作用 变为尿嘧啶U 而甲基化的胞嘧啶则不发生改变 该技术主要对CpG岛甲基化情况进行分析 甲基化和未甲基化的样品被处理后 其碱基序列将不再相同 据此分别设计甲基化引物和非甲基化两对引物去扩增 重硫酸盐处理后的模板 以是否能得到相应的PCR产物确定甲基化情况 若仅能用甲基化引物得到预期的PCR产物 则该片段高度甲基化 若仅能用非甲基化引物得到预期的PCR产物 则该片段未发生甲基化 若两对引物均能得到阳性PCR产物 则说明该片段部分甲基化 技术路线 染色体DNA的制备 染色体DNA的亚硫酸盐处理 引物的设计 PCR扩增 得到结果 2 3重亚硫酸盐测序 1 待测DNA样品用限制性内切核酸酶或超声波破碎处理打断成500 1000bp碎片2 重亚硫酸盐处理碎片 未甲基化C脱氨基转变成U 甲基化