青医现代生化技术复习题——详细答案,可以自行省略.doc

2011年现代生化复习题1、 简述天平的种类、电子天平的使用方法及注意事项1、天平的种类: 台秤 （感量1000mg,称实验动物体重） 托盘天平（感量100mg,粗称固体试剂） 电子天平（感量1mg, 0.1mg，0.01mg 称固体试剂）按精度分可分为两类粗天平：（感量）十分之一（100mg）（感量）百分之一（10mg） 粗天平主要用来称取较多样品或用于配制浓度要求不高的试剂称量。分析天平：（感量）千分之一 （1mg）万分之一 （0.1mg） 十万分之一（0.01mg） 分析天平则用于基准物的称量和配制标准溶液及少量样品的称量。2、电子天平的使用（1）电子天平使用方法 核实天平是否处于水平状态； 开机预热； 取称量纸一张，对折后方天平称量台上；按去皿键，使天平显示值为0.00g； 轻轻叩打试剂瓶，徐徐倒入试剂； 取除过量的试剂弃掉； 关闭电源； 清理称量台及天平周围。 （2）使用电子天平几个注意事项：将天平置于稳定的工作台上避免振动、气流及阳光照射。在使用前调整水平仪气泡至中间位置。电子天平应按说明书的要求进行预热。称量易挥发和具有腐蚀性的物品时，要盛放在密闭的容器中，以免腐蚀和损坏电子天平。经常对电子天平进行自校或定期外校，保证其处于最佳状态。如果电子天平出现故障应及时检修，不可带“病”工作。操作天平不可过载使用以免损坏天平。若长期不用电子天平时应暂时收藏为好。 2、 简述微量移液器的使用及注意事项微量移液器的握法： 手掌握住器液器，拇指按压。微量移液器的使用：（1）设定容量 ：调节体积至所需的刻度。（不允许超出额定范围调整）（2）吸液: 接上Tip头。连续按压数次，以调节空气。按下控制钮至第一档；将移液器吸嘴垂直进入液面下 1-6mm （视移液器容量大小而定）；为使测量准确可将吸嘴预洗 3 次，即反复吸排液体 3 次。使控制钮缓慢滑回原位；移液器移出液面前略等待 1-3 秒；缓慢取出吸嘴，确保吸嘴外壁无液体。（3）排液 : Tip头贴住容器内壁 ； 平稳地把按钮压至第一停点，1秒钟后再压至第二停点； 将剩余液体排净；松开控制钮； 然后按压弹射键弹射出吸嘴。 （4）养护：如液体不小心进入活塞室应及时清除污染物；移液器使用完毕后，把移液器量程调至最上线，垂直放置在移液器架上；根据使用频率所有的移液器应定期用肥皂水清洗或用 60 的异丙醇消毒，再用双蒸水清洗并晾干；避免放在温度较高处以防变形致漏液或不准；发现问题及时找专业人员处理。 5）注意事项： 垂直吸液、慢吸慢放；选择合适的量程范围，不能超过量程使用；选择与移液器匹配的枪头，安装枪头时不要用力太猛；移液器每日用完后，应旋到最大刻度。当移液器吸嘴有液体时切勿将移液器水平或倒置放置，以防液体流入活塞室腐蚀移液器活塞；需要高温消毒的移液器应首先查阅所使用的移液器是否适合高温消毒后再行处理。 3、 分光光度技术的理论依据是什么？如何用分光光度法测定被测物质的浓度？分光光度技术（分光光度法）是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。 其理论依据是Lambert和Beer定律。一、光吸收基本定律Lambert-Beer定律 当一束单色光通过溶液时，一部分被吸收，一部分则透过溶液。 设入射光强度为I0，透射光强度为I， I和I0之比称为透光度（Transmittance，T） ： T= I / I o透光度的负对数称为吸光度（Absorbance，A）或光密度(O.D.) 则可表示为A= -lgT。根据Lambert-Beer定律，吸光度与溶液的浓度成正比，与光束通过溶液的距离(即光程)成正比，用数学表达式表示为： A=KCL 式中C代表该物质的浓度，L代表光程，一般以cm表示。 当C的单位用molL1，L为1cm时，常数K用表示，其单位为Lmol1 cm1，称为摩尔吸光系数，此时上式变为： A = CL摩尔吸光系数:是待测物质浓度C为1molL1，液层厚度为1cm时，在特定波长下所具有的吸光度。 摩尔吸光系数是物质对某波长的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。 根据比尔定律，物质在一定波长处的吸光度与浓度之间有线性关系。因此，只要选择一定的波长测定溶液的吸光度，即可求出浓度。标准曲线： 配制一系列不同浓度的标准溶液,按测定管方法进行吸光度测定。以吸光度为纵坐标，以标准液浓度为横坐标，绘出一条曲线，此曲线即称为标准曲线又叫做校正曲线或工作曲线。在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。4、 简述分光光度计的使用及注意事项仪器的使用时应注意： 1、预热仪器：l 打开电源开关，使仪器预热20min。l 为了防止光电管疲劳，预热仪器时和在不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。2、选定波长： 根据实验要求，转动波长调节器，使指针指示所需要的单色光波长。3、固定灵敏度档：根据有色溶液对光的吸收情况，为使吸光度读数为0.2-0.7，选择合适的灵敏度。为此，旋动灵敏度档，使其固定于某一档，在实验过程中不再变动。一般测量固定在“1”档4、调节“0”点： 轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为“0”处（此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电管不受光照）。5、调节T=100： 将盛蒸馏水（或空白溶液或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，有色溶液放在其它格内，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，转动光量调节器，使透光度T=100，即表头指针恰好指在T=100处。6、测定：轻轻拉动比色皿座架拉杆，使有色溶液进入光路，此时表头指针所示为该有色溶液的吸光度A。读数后，打开比色皿暗箱盖。7、关机：实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。 分光光度计使用注意事项：1、为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。2、比色皿的使用方法：（1）拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污，不得将光学面与硬物或脏物接触。 （2）盛装溶液时，高度为比色皿的2/3处即可，光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用镜头纸或丝绸擦拭。3）凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长期盛放在比色皿中。（4） 比色皿在使用后，应立即用水冲洗干净。必要时可用1：1的盐酸浸泡，然后用水冲洗干净。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。每次做完实验时，应立即洗净比色皿。（5）在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。（6）不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤；（7） 在测量时如对比色皿有怀疑，可自行检测。用户可将波长选择置实际使用的波长上，将一套比色皿都注入蒸馏水，将其中一只的透射比调至95%（数显仪器调置100%）处，测量其他各只的透射比，凡透射比之差不大于0.5%即可配套使用 3、一般应把溶液浓度尽量控制在吸光度值0.1-07的范围内进行测定。这样所测得的读数误差较小。如吸光度不在此范围内，可调节比色液浓度，适当稀释或加浓，使其在仪器准确度较高的范围内进行测定。4、仪器连续使用时间不应超过2 h，每次使用后需要间歇半小时以上才能再用。5、每套分光光度计上的比色杯及比色杯槽不得随意更换。6、分光光度计内放有硅胶干燥袋，需定期更换。5、 简述离心机的种类、使用及注意事项一、离心机的分类按转速的大小(机头的额定最高转速)分为:低速离心机：30103rmin 台式或地面式普通离心机高速冰冻离心机超速冰冻离心机一、离心机的使用：1、开机：将待离心溶液倒入大小适中的离心管中（溶液量不应超过离心管总体积的2/3）。离心管连同管套一起放在粗天平上平衡（管套底部应放置橡皮垫）。对称放入离心机插孔中（不用的管套应拿出），盖紧上盖。开关置于“关”，调速旋钮置于最小，接通电源，打开开关，缓慢启动。用调速旋钮沿顺时针方向缓慢调速，观察转速，达到转速后开始计时。2、关机：停转后打开上盖，轻轻取样。关掉开关，切断电源。离心管套倒立放置，使其干燥。二、离心机使用注意事项1、精密地平衡离心管及其内容物。 一台离心机的套筒只能在该离心机上使用，不能在离心机之间(特别是不同型号的离心机之间)混用套筒。 超速离心机转头是镶置在一根很细的轴上，因此在两支离心管平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围。 制备性超速离心机两离心管平衡时重量之差不得超过0.1g。有的普通离心机带有离心管套筒，平衡时应带上套筒。2、平衡后的一对离心管及其内容物(有时还可能包括离心管套筒)应对称放置，不能错位，不能装载单数的管子，以免因离心所产生的离心力不对称而损坏离心轴。 3、当平衡的离心管及其内容物(或包括套筒)对称放置好后，盖好离心机盖子，打开电源，转动速度调节旋钮，逐步增加到所需要的离心速度，计算离心时间。 4、当离心到达所需要的时间后，再转动速度调节旋钮减速。待离心机自然停止转动后取出离心管。关闭离心机电源，拔掉电源插，清洁整理离心机、离心管、套筒、天平等。5、超速离心机带自动控制的操作系统，待选定离心速度、时间等参数后，按启动开关，离心机即自动开始转动、记录时间，并可自动停机(取决于输入的控制信号)。在离心室被抽成真空前，离心机只作低速运转。 6、超速离心时，应注意选择合适的离心管和转头。根据待离心液体性质及体积选择合适的离心管，装载液体时要按各种离心机具体操作说明进行。有的离心管无盖，液体不能装得过多，以防离心时甩出，造成转头生锈或被腐蚀。制备性超速离心机的离心管，常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管上部凹陷变形。 l 根据转速选择合适的转头，当转速超过所用转头最大转速的 2.5时，转头就会爆炸。l 离心完后，转头应用温水洗涤并干燥，一般水洗就足够了，如必须使用去污剂时应用中性去污剂，不可用碱性去污剂。用中性去污剂擦拭转头，用水除去全部去污剂再用蒸馏水冲净。切勿将转头浸泡在去污剂中。l 洗净的转头放在室温中干燥，更好的办法是将转头擦干，用理发吹风机吹干，转头长期不用应涂一层上光蜡保护。转头在使用中应防止与其他物品碰撞，避免造成伤痕，如果发现有被腐蚀迹象，转头不应再用。6、 何谓电泳？简述电泳的类型及影响电泳的因素电泳的定义 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。 电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。二、影响颗粒电泳迁移率的因素（一）缓冲液 1、缓冲液的 pH 缓冲液的pH决定被分离物质的解离和带电性质、状态，因而会影响迁移率和分离效果。例如：若溶液pHpI，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。若溶液pHpHpI，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的pH离pI越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。 2、缓冲液的离子强度 缓冲液的离子强度一般以0.050.10mol/L浓度为宜。 离子强度低，产热少，电泳快，区带明显扩散； 离子强度高，区带尖锐，泳动距离短，产热多。缓冲液中的离子浓度增加会引起质点迁移率的降低. 其原因是带电质点吸引相反电荷的离子聚集其周围，形成一个与运动质点相反的离子电荷层，离子层不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。 离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响质点的带电量，改变泳动速度。 离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关.(二)电场强度 粒子在电场中的移动速度，与电势梯度（电场强度）成正比。电场强度越高，电泳速度越快，但随着电压的增加，电流加大，产生热效应，易使蛋白质变性而改变性质影响电泳。(三) 电渗 （electro-osmosis） 在电场作用下，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电7、 简述蛋白质定量测定的方法及其原理，说明方法的优缺点1凯氏定氮法方法的理论基础：蛋白质中的含氮量约占其总重量的16左右(1219)，因此通过测定物质中的含氮量便可计算出物质中的总蛋白质含量(假设测定物质中的氮全来自蛋白质)。 总重(蛋白质含量)=含氮量16=6.25含氮量 测定原理蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变成硫酸铵，硫酸铵中的NH4+又可通过蒸馏转变成NH3，用硼酸液吸收后，可由标准盐酸滴定，有含氮量求出蛋白质含量量。此方法测定范围为0.2-1.0mg氮。 缺点： 操作较烦、要求的技术性高、测定过程所需时间长；优点：它是唯一能测定固态和不溶物中蛋白质含量的方法，而且测定的数值较准确可靠(误差约 2)。 2双缩脲法原理 在强碱条件下，肽键(-CO-NH-)的质子被解离，二价铜离子和失去质子的多肽链中的氮原子相结合产生稳定的紫红色络合物，在540560nm处测定其光吸收值，此值与蛋白质的含量在一定范围内呈直线关系。优点：1、标准曲线的线性及重复性较好。2、硫酸铵不干扰此显色反应3、结果不因蛋白的种类不同而变化缺点：灵敏度不太高，测量范围在110mg蛋白/m1。在有大量糖类共存或含有脯氨酸的肽中，测定值可能偏低，并且不适用于不溶性样品的测定3 Fo1in-酚试剂法(Lowry法)原理 本法是双缩脲反应的发展，它结合了双缩脲法中铜盐反应和Folin试剂反应的特点。 试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应。 此法是通过肽链或极性侧链的铜络合物较慢反应及芳香族氨基酸的残基，酪氨酸、色氨酸的迅速反应，把磷钼酸、磷钨酸发色团还原成暗蓝色 (磷钼蓝)，颜色反应和蛋白质含量在一定范围内呈线性关系。 优点：较双缩脲法反应灵敏性提高了100倍；测定范围可在0.03-0.3mg/ml。缺点： 对酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，测定的误差大，这是由它的原理所决定的。 4紫外分光光度法一、原理 由于蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基中的苯环含有共轭双键，蛋白质溶液在 280nm处有一紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，其蛋白质的A280与其浓度成正比。据此可进行蛋白质定量测定。优点： 本法是对样品溶液直接进行紫外分光光度测定，测定后可完全回收，操作简单，快速，温度的影响也小。 只适用于半定量或几个样品中蛋白质的相对定量，特别适用于柱层析的紫外监测，以便迅速判断蛋白质的洗脱分离情况。缺点： 1、与标准蛋白中酪氨酸、和色氨酸含量差异较大的蛋白质，测定时有一定误差。2、若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。5考马斯亮蓝G250染色法原理 1976年由Bradform建立。 考马斯亮蓝G-250具有红色和蓝色两种色调，在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色，当与蛋白质通过疏水作用结合后，变为蓝色。色素对可见光谱的最大吸收值从465nm转移到595nm处。蛋白质含量与A595值呈正比。 在0.0l1.0mg蛋白质/ml范围内。优点： 蛋白质和色素的结合反应很快速，约在2分钟左右的时间内达到平衡，在室温1小时之内是稳定的。缺点： 对不同的蛋白质的相互作用有强有弱，还可引起蛋白质的不可逆变性。6BCA法原理 在碱性溶液中，蛋白质将二价铜(Cu 2+ )还原成一价铜(Cu+)，后者与测定试剂中BCA形成紫色复合物，在562nm处具有最大光吸收。 复合物的光吸收强度与蛋白质浓度呈正比。 优点： BCA法操作简单，灵敏度虽与Folin-酚试剂法相似，但它的试剂十分稳定，因此对时间控制不需要那么严格。显色后，1小时内读A562值无变化。抗干扰的能力强，如去污剂SDS、 Triton X-100、4mol/L盐酸胍、3mol/L尿素对测定均无影响。 缺点：反应时间较长，蛋白质发生不可逆变性。8、 简述核酸提取的基本步骤、一般原则和注意事项。I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中分离纯化核酸总的原则：应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子(蛋白，脂类，多糖类)的污染。核酸制备时应注意的事项:尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 减少化学因素对核酸的降解 减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解：排除核酸酶。 9、 简述DNA提取的基本原理及从外周血提取DNA的步骤。一、原理 哺乳动物的遗传物质分核DNA(即通常所称基因组DNA)和线粒体DNA两种，这两种 DNA可一起分离提取，也可分别提取。分别提取时，先裂解细胞然后分离出细胞核沉淀提取基因组DNA，上清部分提取线粒体DNA。一起提取时用全细胞进行蛋白酶消化，提纯后乙醇沉淀DNA，离心获得全DNA。分散好的动物组织细胞在含有SDS的溶液中用蛋白酶消化分解蛋白质。蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋白质(包括糖蛋白和肽类)及脂类和胺类物质，但糖蛋白的降解物常与DNA一同沉淀下来，干扰限制酶的活性。某些实验室不用蛋白酶K，而单纯依靠酚抽提去除蛋白质，酚能变性蛋白质，而且能将变性的蛋白质溶解在其中。氯仿也是一种有效的蛋白质变性剂，并且能促进两相的分离。DNA上清溶液再经氯仿抽提后用乙醇沉淀，分离纯化DNA。(一)分离白细胞 用普通抗凝剂采集静脉血，4保存待用(二)蛋白酶消化(三)去蛋白（四）乙醇沉淀DNA(五)溶解DNA于TE缓冲液10、 简述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其他因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团(micellae)的混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。特别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电荷的蛋白质SDS复合物。这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。 SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样的蛋白质SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数。11、 简述蛋白质分离纯化的一般步骤及纯化方法蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二)蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品溶解度不同；分子大小不同；带电荷的性质不同；物理吸附性质不同；生物学的亲和性不同。12、 层析技术的概念，分类，主要依据的理化性质层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同