农残分析12农药残留的酶抑制法与免疫测定.ppt

农药残留的酶抑制法与免疫测定技术 6 1酶抑制分析测定法1951年 Giang与Hall应用有机磷和氨基甲酸酯农药在体外对胆碱酯酶具有抑制作用的机理来测定其含量 1968年Mendoza利用薄层 酶抑制技术测定10种有机磷和氨基甲酸酯农药 最小检出量可达纳克水平 1975年Kramer与Gamson用一种与靛酚乙酸酯相似的化合物 测定1 10 g的各种有机磷酸酯化合物 与此同时 Zweig等也测定了甲萘威等农药 进入20世纪80年代 人们开始以来源丰富 取材和制备都十分方便的植物酶源 建立薄层 植物酯酶抑制方法 为酶抑制法的进一步推广和应用创造了条件 6 1 2酶法检测原理有机磷和氨基甲酸酯类农药对参与神经生理传递过程的乙酰胆碱酯酶AChE具有抑制作用 使该酶的分解作用不能正常进行 从而导致底物乙酰胆碱的积累 影响动物正常的神经传导 引起中毒或死亡 可将这一昆虫毒理学原理应用到农药残留检测中 如果农产品样品提取液中不含有或含有很低的有机磷或氨基甲酸酯类农药 酶的活性就不被抑制 试样中加入的基质就被酶水解 或少部分水解 水解产物与加入的显色剂反应产生颜色 反之 如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药 酶的活性就被抑制 试样中加入的基质就不被酶水解 从而不显色或颜色很浅 用分光光度计测定吸光度值 计算出抑制率 就可判断出样品中农药残留情况 6 1 3酶源选择与提取酶源选择是生物酶技术应用的基础 其性质的好坏 特异性大小 稳定与否直接关系到检测的结果 在酶抑制检测的技术中 既有应用AChE的 也有应用非特异性酯酶的 其来源既有动物的 也有植物的 6 1 4底物和显色剂酶抑制剂显色反应可使用的底物和显色剂很多 大致可分为以下几类 1 乙酰胆碱 溴百里酚蓝显色 2 乙酸 萘酯 固蓝B盐显色反应 3 乙酸羟基吲哚显色法 4 乙酸靛酯显色法 6 1 5检测方法 1 比色法 我国农业部农药检定所利用酶抑制产生的显色反应 通过分光光度计比色测定酶的抑制率 以测定有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量 2 酶片法 酶片即为浸渍有胆碱酯酶或其他敏感酶类的滤纸或类似载体物质 3 固相酶速测技术6 2免疫检测技术6 2 1免疫分析概述当细菌 病毒和有害物等病原入侵时 能产生抵御外来物的抗体 这就是动物的免疫反应 致病的外来物称为抗原 免疫分析是以抗原与抗体的特异性 可逆性结合反应为基础的分析技术 6 2 2酶联免疫吸附测定法 ELISA 原理是在测定过程 样品提取液中的农药与已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸附位点 为了观察测定结果 往往加入底物和显色剂 以产生颜色变化 根据样品颜色和标准物质颜色的吸光度之差就可计算出样品中农药的含量 农药残留免疫分析方法的建立 一般包括待测农药的选择 半抗原合成 人工抗原合成 抗体制备和样品前处理方法等几个步骤 1 直接ELISA原理 是在抗原与抗体发生反应后 直接进行显色的非均相固相反应免疫分析方法 1类 首先将抗原固定在聚苯乙烯反应板孔内壁 然后加入待测抗原和酶标记抗体 固相抗原与待测游离抗原竞争有限量的酶标记抗体 反应后洗去可溶性的游离抗原与抗体的结合物 加入酶作用底物 测定固相抗原与抗体结合物上的酶活性 便可得到待测抗原的量 酶反应活性与待测抗原的量呈负相关 2类 首先固定抗体 然后同时加入待测抗原和酶标记抗原 待测抗原与酶标记抗原竞争有限量的固相抗体 反应后测定固相抗体与酶标记抗原结合物上的酶活性 便可得到待测抗原的量 酶活性强度与待测抗原呈负相关 2 间接ELISA原理首先固定抗原 然后加入待测抗原和抗体 固相抗原与待测抗原竞争有限的第一轮抗体 反应后洗去游离的结合物 再加入酶标记的第二抗体 以第一抗体为抗原的酶标记抗体 反应后吸取酶标记的游离抗体 测定结合物上的酶活性 酶活性与待测抗原浓度呈负相关 3 半抗原的制备抗原是指一切能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞 并能与之结合发生特异性免疫反应的物质 抗原具有免疫原性和反应原性 免疫原性是指能刺激机体产生抗体或能诱导机体产生免疫应答反应 而反应原性是指能与其诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞进行反应的特性 既具有免疫原性反又具有反应原性的抗原称为完全抗原 而只具有反应原性而没有免疫原性的抗原称为不完全抗原 也称半抗原 4 人工免疫抗原的合成首先将半抗原活化 然后通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合 如半抗原分子含有羧基 可用碳二亚胺法或混合酸酐法 如具有羟基活性基团则采用琥珀酸酐法 5 农药抗体制备农药抗体是经由小分子农药与大分子载体偶联后的复合物免疫动物使机体产生抗农药的抗体 并取其免疫动物血清 然后进行分离 鉴定其特异性而得到的 农药抗体的产生一般可采用两种途径 1 多克隆抗体技术多克隆抗体是由许多B淋巴细胞克隆产生的混合抗体 2 杂交瘤技术生产单抗单克隆抗体是指由一个B淋巴细胞分化增殖的浆细胞产生的针对单一抗原决定簇的抗体 6 ELISA方法的选择分为五种类型 1 酶标抗原直接竞争抑制法 2 酶标抗体直接竞争抑制法 3 酶标抗体间接竞争抑制法 4 抗体夹心法 5 间接夹心法 7 实验条件的选择必须注意以下几个方面 1 确定酶结合的最适浓度 2 确定包被物质的最适浓度 3 样品往往会产生交叉反应 4 样品前处理时 使用的溶液必须考虑其影响抗体对分析物识别的可能性 8 ELISA法的特点 1 适用现场快速筛选 2 适用常规方法难以检测的农药 3 适用环境监控 6 3生物传感器在农药残留检测中的应用6 3 1生物传感器的原理生物传感器是指由一种生物敏感部件与转换器紧密配合 对特定种类物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置 传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析物之间 如酶与底物 抗原与抗体 外源凝集素与糖 核酸与其互补片段之间的识别反应会产生一些物理化学信