感受态制备、蓝白斑筛选

分子医学实验 感受态细胞的制备质粒转化入大肠杆菌及初步筛选 复习 基因克隆示意图 基因克隆操作过程 基因工程 一 感受态细胞及重组体转化 重组体转入受体菌 转化 transformation 转染 transfection 转导 transduction 转化是将含有目的基因的质粒导入细菌内进行表达 转染是将含有真核生物基因的噬菌体感染细胞 转导则是指病毒从被感染的细胞 供体 释放出来 再次感染另一细胞 受体时 发生供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组 重组DNA分子导入受体细胞的手段 转化方法 CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性改变 感受态 competent 宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态 处于感受态的细胞称为感受态细胞 正常细胞都有细胞膜 细菌还有细胞壁 作屏障 对外源分子选择性接受 在实验中通过一定的理化条件使细胞通透性增大 处于感受态 制备感受态细胞和转化的常用方法CaCl2转化程序法 传统方法 转化效率能达到5 106 2 107转化子 g质粒DNA 简单 快速 重复性好 菌株适用范围广 电穿孔转化法 脂质体 liposome 法 胞核的显微注射法 microinjection 磷酸钙介导的转染 聚乙二醇介导的原生体转化法 CaCl2法制备感受态细胞和转化的原理一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低 难以转化成功 当细菌处于冰冷 0 0 05 0 1M的CaCl2低渗溶液中 菌体的细胞膨胀成球形 细胞膜的通透性增加 对DNA的摄取能力增强 转化效率提高 感受态细菌 同时在转化体系中的DNA形成的抗DNase的羟基 钙磷酸复合物能粘附于细菌表面 经过42 短时间热休克 heatshock 处理 促进感受态细胞吸收DNA复合物 在丰富培养基上生长1小时后 球状细胞复原并分裂增殖 重组子中的基因在转化细菌中得到表达 在选择性培养 selectiveculture 平板上即可筛选出所需的转化子 0 1mol LCaCl2 0 重组体 感受态细胞 转化 transformation 在分子克隆技术中 转化特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程 区别转化 转染 transfection 与转导 transduction 转化与感受态细胞 二 感受态细胞制备及重组体转化的实验操作及注意事项 细菌转移到一冰冷的1 5ml的EP管 40C 4000rpm 5min 弃上清 沉淀中加入冰冷的0 1mol LCaCl2300 l 重悬菌体 冰浴20min 40C 4000rpm 5min弃上清 将管倒置于滤纸上1min 使液体流干净沉淀中加入冰冷的0 1mol LCaCl2100 l 重悬菌体 冰浴10min 冰浴10min后 每管加入质粒5 l 轻轻旋转试管 混匀混合物 在冰浴上放置20min 试管放入420C的水浴中 放置90s 不要摇动试管 迅速将试管转移到冰浴 冷却1 2min 取出试管后 每管加入LB培养基800 l 置于370C摇床 100 150r min 温和震荡45min用无菌弯头玻璃铺菌器将200 l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面室温放置20min 使液体被吸收 发汗 倒置平皿 370C培养 12小时可见菌落生长 三 重组体的筛选 重组体克隆的筛选与鉴定 由于重组率和转化率不可能达到理想极限 因此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNA的阳性克隆 筛选的依据 基因载体的特点 受体细胞的特性和外源基因的表达 筛选的方法 抗药性标志的选择插入表达筛选 半乳糖苷酶系统筛选 互补 半乳糖苷酶能将X gal转变为不溶性的深蓝沉淀 插入失活法 抗药性标记选择 目录 菌落杂交筛选法内切酶图谱鉴定PCR筛选重组子Southern印迹杂交和菌落原位杂交DNA序列分析免疫化学检测法 原理 基因载体上含有 半乳糖苷酶 LacZ 的基因 当外源DNA插入到载体的LacZ基因上后将造成 半乳糖苷酶失活 就不能分解培养基中的X gal 5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 产生蓝色产物 结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含有X gal IPTG 异丙基 D 硫代半乳糖苷 培养基的颜色变化直接观察出来 蓝白斑实验 互补的检测 目录 U6 原位杂交 目录 Southern印迹 目录 鸡的 肌球蛋白的克隆和检