药学职称论文地龙药材蛋白质电泳鉴定的初步研究.doc

资料提供者： 上海论文网 地龙药材蛋白质电泳鉴定的初步研究摘要:目的探讨聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对地龙药材进行鉴别的可行性,为地龙的品种鉴定以及药材品质评价提供参考依据。方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对不同来源、不同品种,不同加工方法的地龙药材进行可溶性蛋白质电泳研究。结果电泳图谱中广地龙在66. 2 14. 4 KDa 分子量之间存在5 条清晰、稳定的条带,可初步认定其为广地龙的特征鉴别条带。不同品种的地龙在蛋白质电泳图谱谱型和谱带的强弱、蛋白质相对含量上均有一定的差异;地龙鲜品和干品在蛋白质谱带的强弱上有一定差异。结论聚丙烯酰胺电泳方法可以用于不同品种地龙的鉴定以及品质评价。关键词:地龙;聚丙烯酰胺凝胶电泳;品种鉴定;品质评价 地龙又名蚯蚓,是我国常用传统中药,为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E. Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris (Chen)、威廉环毛蚓 Pheretima guillelmi ( Michaelsen ) 和栉盲环毛蚓 Pheretima pectinifera(Michaelsen)的干燥体。前1 种习称“广地龙冶,后3 种习称“沪地龙冶1 。具有清热定惊、通络平喘、利尿等功效,临床应用广泛2 。自然界蚯蚓的品种繁多,目前我国已记载的有300 多种3 ;各地医家作为药用的地龙在分类学上就有3 科4 属49 种之多4 。由于地龙来源十分复杂,故其品种质量直接影响到临床用药安全。但国内外对地龙的研究主要集中在生药学性状的比较鉴别5 、有效成分的提取分离6 、药理与临床7 等方面,而有关品种鉴别方面研究较少。当前地龙药材标准中也缺少特异性强、行之有效的鉴定方法,如地龙原动物品种的性状鉴别,要求必须是性成熟的个体,而对于幼体或经过多道工序炮制加工后的地龙药材则难辨真伪5 。 鉴于地龙体内主要含蛋白质脂肪等大分子成分6 ,本研究探索利用擅长分离鉴定蛋白质混合物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS鄄PAGE) 技术8 -9 ,对不同来源地龙及地龙不同炮制品的蛋白质差异进行比较研究,为完善地龙药材质量标准提供实验依据,同时也为其它动物类中药的鉴定提供方法学的参考。1.仪器、材料与试剂1. 1.材料 分别收集自各地的10 批地龙药材干品,以及3 批不同品种的地龙原动物鲜品,经广州中医药大学中药鉴定学教研室李薇教授进行形态鉴别分类,材料编号、品名及来源等见表1。表1.样品信息表 Table 1.Information of samples 编号名称批号产地购买地或采集地拉丁名 1 地龙20080701 广东广东国药医药连锁企业有限公司Ph. aspergillum(E. Perrier) 2 地龙20090801 广西康乐医药商店Ph. aspergillum(E. Perrier) 3 地龙20090721 广东广州市海王星辰连锁有限公司天河区分店Ph. aspergillum(E. Perrier) 4 地龙20090909 广西广东兴和堂药业连锁有限公司Ph. aspergillum(E. Perrier) 5 地龙20090801 广东广东大森林连锁药店有限公司Ph. aspergillum(E. Perrier) 6 地龙20090919 广东广东济和堂药业连锁有限公司Ph. aspergillum(E. Perrier) 7 地龙20090521 广东广东海王星辰连锁有限公司海珠区分店Ph. aspergillum(E. Perrier) 8 地龙20090701 广东康乐医药商店Ph. aspergillum(E. Perrier) 9 地龙20090526 广西广州二天堂大药房连锁有限公司Ph. aspergillum(E. Perrier) 10 地龙20090501 广东广州采芝林药业连锁店Ph. aspergillum(E. Perrier) 11 威廉环毛蚓20100427 广东广州大学城Ph. guillelmi Michaelsen 12 栉盲环毛蚓20100427 广东广州大学城Ph. pectinifera Michaelsen 13 三星环毛蚓20090701 香港慈姑山Ph. Triastriata1. 2.仪器 SHIMADZU鄄AUY120 型电子分析天平(日本岛津);DYY鄄6C 型凝胶电泳仪(北京六一仪器厂), DYC2鄄23A 型垂直电泳槽(北京六一仪器厂);TG16鄄 W 微量高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司), HK3300H 超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司),PHS鄄30 酸度计(上海精密科学仪器有限公司)。1. 3.试剂 丙烯酰胺(Acr)、N,N鄄甲叉双丙烯酰胺(Bis)、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸胺(Ap)、三羟甲基胺基甲烷(Tris)、甘氨酸、考马斯亮蓝R鄄250、十二烷基磺酸钠(SDS)、低分子蛋白标准(6 条带:14. 4 97. 4 KDa)均购自北京奇华盛生物技术有限公司; 甘油、蔗糖、溴酚蓝、冰乙酸、乙醇、甲醇均为分析纯, 购自广州文睿科学仪器公司;水为双蒸水。30%凝胶储备液:Acr 29 g 和Bis 1 g,加双蒸水溶解后定容至100 mL,4 益避光保存。分离胶缓冲液:Tris 18. 16 g,溶解于80 mL 双蒸水中,用4 molL-1 盐酸调至pH 8. 9,加双蒸水稀释至100 mL,4 益避光保存。浓缩胶缓冲液:Tris 12. 12 g,溶解于80 mL 双蒸水中,用4 molL-1 盐酸调至pH 6. 7,加双蒸水稀释至100 mL,4益避光保存。样品缓冲液:浓缩胶缓冲液2.0 mL,10%(质量分数)的SDS 5 mL, 茁-巯基乙醇1.25 mL,蔗糖1.5 g,溴酚蓝0.125 g,用双蒸水稀释至25 mL。新鲜配制。电极缓冲液:Tris 15. 14 g 和甘氨酸72. 07 g,加入10% (质量分数)的SDS 50 mL,加双蒸水稀释至 1 L,4 益避光保存。用时稀释5 倍。染色液:考马斯亮蓝R鄄250 0. 625 g,加入甲醇 115 mL 和冰醋酸20 mL,加双蒸水稀释至250 mL。脱色液:冰醋酸50 mL 和95%(体积分数)乙醇 150 mL,加蒸馏水稀释至500 mL。2.方法与结果2. 1.样品前处理方法考察 加入不同类型提取液2 mL,在匀浆器中充分研磨使成稀糊状,3 000 r/ min 离心5 min,取上清液,在4 益冰箱中放置过夜,再于3 000 r/ min 离心5 min,取上清液,按“2. 3冶项下条件在同一凝胶板上进行电泳。结果见图1。 1. 样品量0. 6 g,水提取; 2. 样品量0. 6 g,0. 15 molL-1 NaCl 液提取; 3. 样品量0. 6 g,0. 30 molL-1 NaCl 液提取; 4. 样品量0. 3 g,水提取; 5. 样品量0. 3 g,0. 15 molL-1 NaCl 液提取; 6. 样品量0. 3 g,0. 30 molL-1 NaCl 液提取。Figure 1.SDS - PAGE chromatogram of samples extracted by different conditions 由图1 可知,6 种不同前处理方法下的样品谱带基本一致,但方法1 和4 所得样品谱图较其他4 组样品的而言,条带较少且模糊。方法2 所得样品的谱带最为清晰明亮,可辨识度高,故选取其作为本研究的样品蛋白质提取条件,即每0. 6 g 药材用 0郾15 molL-1 NaCl 溶液2 mL 匀浆提取。2. 2.样品稳定性考察 取表1 中2 号地龙药材样品,按上法制备地龙提取液,分别于放置0、24 和72 h 后,按“2. 3冶项下条件进行电泳取样、测定。结果显示,地龙的新鲜制备提取液与分别放置24、72 h 后提取液所得到的谱带无明显区别。表明放置时间不同对地龙样品电泳行为影响不大。 2. 3.电泳操作 点样时,取按“2. 1冶项下方法制备的样品液30 滋L 与样品缓冲液30 滋L 混合,点样前60 益水浴加热5 min。用微量注射器取30 滋L 上述混合液,注入样品槽底部。设置初始电流为10 mA,待样品进入分离胶时,将电流调至20 30 mA。当蓝色染料迁移至距离凝胶下缘1 cm 时,停止电泳。取出凝胶板,在胶板一端切除一角作为标记,将胶板移至大培养皿中染色。2. 4.染色和脱色 取出胶板后,用蒸馏水冲洗,随即浸入考马斯亮蓝R鄄250 染色液中,置恒温箱中38 益染色2 h 后取出,用脱色液浸泡漂洗数次,每次更换脱色液,直至背景清晰为止。不同地龙药材样品蛋白质电泳行为的比较选取不同批次及不同产地地龙药材(干品)于相同条件下处理得样品1 10,在同一条件下进行电泳,比较其蛋白谱带的区别,结果见图2。1 10. 同表1 中的1 10; M. 低分子蛋白标准。图2.10 种广地龙干品药材蛋白原图(A)及示意图(B) Figure 2.Electrophoresis patterns of soluble proteins of Dilong from 10 different origins 从图2 可知,10 批地龙药材在66. 2 14. 4 KDa 分子量之间有5 条相同的条带,其中在66. 2 43. 0 KDa 之间2 条、31. 0 KDa 附近2 条、14. 4 KDa 附近 1 条。不同产地不同批号的地龙药材所表现的蛋白条带有所不同,样品1、4、5、6、9、10 在共同条带外有其他条带。不同地龙原动物品种蛋白质电泳行为的比较选取不同物种的鲜品地龙在同一条件下进行电泳,比较其蛋白谱带的异同,结果见图3。 1. 威廉环毛蚓; 2. 栉盲环毛蚓; 3. 三星环毛蚓; M. 低分子蛋白标准。 3 种不同物种鲜品地龙蛋白谱带原图(A)及示意图 (B) Figure 3.Electrophoresis patterns of soluble proteins of Dilong from 3 different species 3 种不同物种鲜品地龙对比,其特征蛋白条带的位置及数量均有不同。其中威廉环毛蚓在31. 0 KDa 附近、20. 1 14. 4 KDa 分子量之间存在2 条清晰明显的蛋白谱带;栉盲环毛蚓在43. 0 KDa 附近、 31.0 KDa 附近、20. 1 14. 4 KDa 分子量之间存在3条清晰明显的蛋白谱带;三星环毛蚓在97. 4 66. 2 KDa、43. 0 KDa 附近、20. 1 14. 4 KDa 分子量之间存在3 条清晰明显的蛋白谱带。故可利用其蛋白条带的差异来区分3 种不同物种的地龙。3.讨论 曾尝试利用甲醛处理过的地龙标本提取蛋白质,但效果不理想,推测是蛋白质在甲醛的作用下产生了变性所致。试验中所有药材(干品及鲜品)均需在冰浴下进行匀浆,以避免局部温度过高造成的蛋白破坏。加入适量NaCl 溶液有利于样品蛋白质的溶出,条带明显且清晰;试验用蛋白质提取液的稳定性良好,供试品在4 益冰箱中放置3 天后,仍可获得良好的电泳结果。 本文从方法学角度考查了SDS鄄PAGE 技术检测不同地龙样品所含的蛋白质类成分的可行性,其实验结果理想。广地龙药材在本试验提取条件下,在 66. 2 14. 4 KDa 分子量之间存在5 条清晰、稳定的蛋白特征条带,可初步认定其为广地龙的特征鉴别条带。 不同产地不同批号的地龙药材所表现的蛋白条带有所不同,样品1、4、5、6、9、10 均在共同条带外有其他条带;然而从样品产地和来源来看,未见明显规律。10 批药材样品蛋白条带的差异可能是因为药材炮制或者保存条件不同,导致样品蛋白质受到破坏或变质所致。样品1 为冷冻保存,条带较清晰,提示冷冻保存地龙干品可能在一定程度上能保护蛋白不受破坏。较之10 批地龙干品,3 批地龙鲜品的蛋白质含量均较高,图谱条带均颜色较深,也进一步说明炮制过程会使蛋白质发生破坏和变化。提示地龙药材生产过程中,应统一加工方法,并低温保存药材。 本研究直接针对地龙类药材活性成分进行分析,弥补了地龙药材现行质量标准中缺少蛋白质类成分专项鉴定的不足。由于SDS鄄PAGE 操作简便易行,且电泳谱带稳定、重现性良好,对于地龙类药材品种鉴定具有推广应用的价值。参考文献:1 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:2010 年版一部 M. 北京:中国医药科技出版社,2010:113.2 李廷利,李玉萍,冯翰,等. 地龙的化学成分与临床应用概况J. 黑龙江医药,2006,19(4):303 -304.3 黄健,徐芹,孙振钧,等. 中国蚯蚓资源研究:玉. 名录及分布J. 中国农业大学学报,2006,11(3):9 -20.4 于德江,刘亚杰,迟仁智,等. 中药材地龙J. 中国药学杂志,1993,28(10):594 -596.5 吴文如,李薇. 地龙类药用动物的比较鉴别J. 现代生物医学进展,2007,7(11):1