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重组蛋白纯化的基本策略作者：佚名实验频道来源：本站原创点击数： 1241更新时间：2004-12-21及的具体步骤最终取决于样品的性质。但也有共同可参考的阶段 捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。 中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。 精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择 根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC） 每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。 分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。 处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。 速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。 回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。 在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险提示：1、 通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。2、 硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。4、 在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或和处理量的方法5、 如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。6、 只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC方法用于精制阶段。注：应该指出，三阶段纯化策略
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