血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验.doc

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验一实验原理1、电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。2、影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。3、影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。4、采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。5、醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。6、本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为1-、2-、-及-球蛋白。二实验仪器和试剂 器材 醋酸纤维素薄膜（38cm），培养皿，载玻片，电泳仪，电泳槽，粗滤纸，镊子 材料新鲜血清（未溶血） 试剂1、巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.06）：巴比妥1.66g, 巴比妥钠12.76g，加水至1000ml。置4冰箱保存，备用。（已配置）2、染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸馏 水40ml，混匀。3、漂洗液：含95乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。 4、NaOH溶液：称取NaOH 16g，定容至1000ml。三实验过程一.准备与点样 1.将薄膜剪成38cm的小条，在薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻轻划一条直线，表示点样位置。 2.将薄膜无光泽面向下，浸泡于PH8.6的巴比妥缓冲液中至少十分钟，使之完全浸泡透。 3.将浸泡的薄膜取出，用滤纸吸去多余水分。用毛细管吸取新鲜血清约5ul，涂于厚0.5厘米的载玻片末端，然后轻轻压在划痕处，待血清完全浸入膜内以后移开载玻片。 二、电泳 将点样后的薄膜置于电泳槽支架上，无光泽面朝下，点样末端置于负极。槽架上用四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸必须贴紧，平衡5分钟后通电，电压110伏，电泳1小时左右关电源。三、染色和漂洗 通电完毕后，用镊子将膜取出，直接浸于染色液中2分钟后取出，立即浸泡于漂洗液中，反复漂洗，直至背景漂洗净为止。用滤纸吸干薄膜。四、定量（洗脱法）取6支试管，编号，每管加入0.4mol/LNaOH4毫升，剪下薄膜 上各条蛋白色带。另于无色部分剪一大小与色带相仿的薄膜作空白对照。将各条区带分别放入试管内，不时摇动，待蓝色完全脱下后。在波长650nm处比色。以空白调零，分别读出各蛋白组分的光密度，然后计算出总光密度： 光密度总和T=清蛋清（A)+A1+A2+B+ r各管的0.D。各部分蛋白质的百分数为： 清蛋白A=A/T1球蛋白= 1/T 2球蛋白= 2/T球蛋白= /T球蛋白= /T四注意事项 保持薄膜清洁，务必戴上塑料手套，勿用手指接触薄膜表面，以免油污或污物沾上，影响电泳结果。 注意醋酸纤维膜的质量，至少浸泡10分钟，浸泡很久仍有大块白色硬点者须弃之不用。 加样时一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动的区带整齐、不歪。以免影响蛋白质区带图谱的完美。 电泳槽两边的缓冲液应保持液面在同一水平面上，槽里的缓冲液要保持清洁。 电泳电压大小，时间长短与缓冲液的离子强度都有一定的关系。一般电流约0.40.6mA/cm,电压110160V，通电时间4060min。电压高，电流大，电泳速度加快，时间可缩短，但薄膜上蒸发严重，因此不能无限增大电流。 使用比色皿时要润洗。 染色的同时也是蛋白质的固定，所以，不要将很多蛋白条重叠在一起。 注意薄膜正负极不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。放的时候注意血样不要与滤纸接触了。 通电完毕时，必须切断电源，以防触电事故。五、失败图谱的分析 拖尾状 点样量过多，被分离的血清蛋白不能分离成5条区带或产生拖尾。 有斑点 点样不均匀，不整齐，导致被分离的区带出现斑点。 边流现象 点样板蘸取血清一边多一边少，导致区带分离不清，出现边流现象。 区带模糊 薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带。 锯齿状 薄膜用滤纸吸水过度（薄膜上出现白斑）或点样过慢，又未及时大桥，导致薄膜过于干燥，使区带成锯齿状。 区带倾斜 薄膜搭载滤纸上的位置歪斜，弯曲，与电流方向不平行，或点样一边多一边少，区带容易泳斜。 显色过浅 点样太少，区带显色不明显。 区带重叠 染色时，醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上