核酸体外扩增技术综述.doc

核酸体外扩增技术研究进展摘要 体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术，自问世以来，被广泛应用于分子生物学、医学和法理鉴定等领域，并被不断改进，以使其功能和适应性更为广泛。核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展,出现了越来越多的核酸体外扩增技术。就现有的核酸扩增技术的原理、特点及应用进行介绍。关键词 核酸体外扩增 聚合酶链式反应（PCR） 等温扩增核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，蛋白质是生命活动的表达物质，基因则是编码蛋白质的特异的核苷酸序列，因而核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。而在1983年人类第一次能够在体外扩增DNA之后，对核酸的操作和利用进入了一个全新的革命性的阶段，直到现在，体外核酸扩增技术仍然在不断地改进和完善，新的核酸扩增模式也不断涌现1。一、 聚合酶链式反应(PCR)PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面2。聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。已经建立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。前者包括聚合酶链式反应（PCR）、链替代扩增（SDA）、连接酶链式反应（LCR）和依赖核酸序列的扩增（NASBA）等，这些方法都具有很高的灵敏度。信号放大扩增包括技术核酸（bDNA）、杂交捕获、侵染(Invader)和通过扩增替代分子来检测靶核酸等方法。而滚环增（RCA）是一种既能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大扩增的方法。二、 核酸等温扩增技术等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用，其他一些新发展起来的等温扩增技术，如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术，也在不断发展与完善之中3。1、链替代扩增技术链替代扩增，又叫链置换扩增，是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术，主要利用限制性内切酶剪切DNA识别位点的能力和DNA聚合酶在切口处向3延伸并置换下游序列的能力，在等温条件下进行扩增。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。SDA的基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。整个过程由准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环扩增3个步骤组成。2、滚环扩增技术滚环核酸扩增（rolling circleamolification，RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA的方式而提出的，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA完全互补）的线状单链。线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体。指数RCA原理与线性RCA 相同，采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针的模板，这样一来在很短的时间内，产物呈指数递增。3、依赖解旋酶DNA扩增依赖解旋酶DNA等温扩增技术是美国NEB公司于2004年发明的一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内DNA复制的自然过程，利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，再由DNA单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板，然后在DNA聚合酶的作用下合成互补的双链，继而不断重复上述循环扩增过程，最终实现靶序列的指数式增长。4、依赖核酸序列扩增依赖核酸序列扩增技术是一项以核酸序列中RNA为模板，由两个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程4。5、环介导等温扩增环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA在65左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成5-6。6、单引物等温扩增技术单引物等温扩增技术的核心是一条混合引物及可以切割DNA/RNA杂合链中RNA部分的RNA酶，由由3端DNA部分和5端RNA部分组成。切割酶作用后暴露出模板上与引物RNA部分结合的位点，然后新引物结合上去进行链置换合成，经过RNA降解、新引物结合、链置换的循环过程，实现模板互补序列的快速扩增。7、快速等温检测放大技术快速等温检测放大技术最早由中科院研究人员于2005年发明。技术的核心是在待检测样品的核酸中加入含有切刻内切酶识别位点的单链检测探针及切刻内切酶，检测探针与目标基因序列杂交后形成切刻内切酶识别位点，该位点仅可使切刻内切酶在检测探针链切割，形成两小片段，小片段从目标序列脱落，另一DNA探针再与目标序列结合产生小片段，如此循环可得。8、Q复制技术Kacian等于1972年首次报道了Q复制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板自我复制的功能。Q复制酶是Q噬菌体产生的一种依赖于RNA的RNA聚合酶，以单链RNA为模板，在体外大量复制单链RNA，也可以指数式扩增重组DNA分子。三、 展望核酸分子体外扩增是生物技术研究的重要手段。随着科学的发展和研究目的不同，出现了越来越多的核酸分子体外扩增技术。目前，基于PCR技术的检测方法是转基因检测的常规方法。尽管传统PCR有着各种各样的优点，但在应用方面，还有其自身的缺点。例如，循环中需要高精度的温度循环，扩增抑制剂对灵敏度的影响等，这些在转基因检测的应用中都是至关重要的。等温扩增技术不需要高精度的热循环仪，非常适应于现场检测。其他可选择的核酸扩增方法在某些方面也弥补了传统PCR技术的不足。参考文献1 陈庆山，刘春燕，刘迎雪，等核酸体外扩增技术J中国生物工程杂志，2004，24(5)：10132 吕蓓，程海荣，严庆丰，等体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新J中国生物工程杂志，2011，31(3)：91963 马丽敏，卢亦愚核酸等温扩增技术研究进展J浙江预防医学，2013，25(1)：24274 高闪电，常惠芸，丛国