基因工程中常用的工具酶

二 基因工程的基本程序 载体质粒 外源DNA片段 外源DNA插入 剪切 引入宿主细胞 选出含有重组DNA的细胞扩增表达 a b b A A b 第二章基因工程中常用的工具酶 第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第二节DNA连接酶和DNA分子的体外连接第三节其他工具酶 第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体切割 限制性核酸内切酶 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列 并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶 一 寄主控制的限制与修饰作用如图2 1 图2 2二 限制性核酸内切酶的制备方法三 限制性核酸内切酶分类和命名四 型限制性核酸内切酶的基本特性五 影响限制性内切酶活性的因素 分类 识别和切割位点不固定 随机性 核酸内切酶活性和甲基化活性是不分开的 能在识别位点处切割DNA 切割位点固定 核酸内切酶活性和甲基化活性是分开的 常用 四 型限制性核酸内切酶的基本特性 识别序列 1 4 7个核苷酸组成的特定核苷酸序列2 回文结构 两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列 EcoR 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 经限制酶切割后的位点 DNA断裂类型1 粘性末端 1 3 OH单链延伸的粘性末端 如 Pst 5 CTGCAG 3 5 CTGCAG 3 3 GACGTC 5 3 GACGTC 5 2 5 P单链延伸的粘性末端 如 EcoR 5 GAATTC 3 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 3 CTTAAG 5 2 平末端如 Sma 5 CCCGGG 3 3 GGGCCC 5 两种特殊的限制酶 1 同尾酶识别位点不同 酶切后产生同样的粘性末段的两种酶 如 BamH 和Bgl 2 同裂酶识别序列相同 对甲基化切点敏感性不同的两种酶 如 Mbo 和Sau3A 共同识别序列GATC 但对GmeATC切点 前者不能切 后者能切 五 影响限制性内切酶活性的因素1 DNA的纯度2 DNA的甲基化 1 基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌 2 研究基因工程DNA的甲基化程度 3 改变限制酶的识别特性3 温度4 分子结构5 限制酶的缓冲液星号活性EcoR 切GAATTCEcoR 切pupuATpypy或AATT 第二节DNA连接酶和DNA分子的体外连接 一 DNA连接酶DNA连接酶 Ligase 是一种能够催化在双股DNA链的3 OH和5 P之间形成磷酸二酯键的酶 可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复 不能连接单链DNA或裂口 温度二 DNA分子的体外连接 二 DNA分子的体外连接 1 粘性末端DNA片段的连接和单切点的磷酸化2 平末端DNA片段的连接 1 T4DNA连接酶法 2 同聚物加尾法 3 用化学合成的衔接物连接DNA分子 第三节其他工具酶 一 大肠杆菌DNA聚合酶 二 DNA聚合酶 大片段 Klenow酶 三 T4DNA聚合酶四 逆转录酶五 末端脱氧核苷酰转移酶六 核酸酶S1七 核酸酶BAL31八 外切核酸酶 九 T4多聚核苷酸激酶十 碱性磷酸酶十一 甲基化酶 命名 Hind H Haemophilus嗜血杆菌属in influenzae流感d Rd株 该菌株中第三个被分离到的限制酶 同尾酶BamHI和BglII AGATCT GGATCC TCTAGA CCTAGG Bgl BamHI AGATCC TCTAGG T4连接酶AGATCC 连接后的切点均不能被上述两种酶切 TCTAGG 一 大肠杆菌DNA聚合酶 1 三种活性 1 5 3 聚合酶活性 在有dNTP时 2 3 外切酶活性 无dNTP时大亚基活性 3 5 外切核酸酶活性 无dNTP时小亚基活性 2 在基因工程中的应用 缺口平移标记技术 二 DNA聚合酶 大片段 Klenow酶 1 DNA聚合酶活性 切除小亚基 保留大亚基 2 3 外切酶活性 无dNTP时 3 在基因工程中的应用 1 标记粘性末端 32P dNTP标记平末端 32P dNTP 2 将5 端伸出的末端填平 3 可用来反转录合成双链cDNA 4 补平粘性末端 三 T4DNA聚合酶 具有5 3 聚合酶活性和3 5 外切酶活性 其外切酶活性比E coliDNA聚合酶I的活性高200倍 取代反应 四 逆转录酶 逆转录酶可以RNA为模板 逆转录成cDNA第一链 又称依赖RNA的DNA聚合酶 1 聚合酶活性RNA或DNA为模板2 3 外切酶活性能使DNA RNA杂合链中的RNA降解 应用 1 RT PCR使mRNA逆转录成cDNA2 制备探针 五 末端脱氧核苷酰转移酶 可催化DNA片段上的3 OH端加接脱氧核糖核苷酸 常用于同种碱基多聚体接尾反应核素标记DNA片段的3 端 六 核酸酶S1 可以降解单链DNA和RNA 1 将DNA切成平末端 有些限制性内切核酸酶可以将DNA切成粘性末端 经过核酸酶S1降解可切除DNA末端的单链 生成平末端DNA 2 切除cDNA中单链发夹状结构 反转录反应合成的cDNA 可能形成单链发夹状结构 为了得到平末端cDNA可用核酸酶S1分解 生成无发夹结构的cDNA 3 可用核酸酶S1分析DNA RNA杂交分子的结构 十 碱性磷酸酶 该酶的功能是以单链或双链的DNA RNA为基质 将DNA或RNA片段5 端的磷酸切除 产生5 OH 应用 1 用该酶催化切除DNA或RNA5 端的磷酸 然后加上 32P NTP在DNA多聚核苷酸激酶的作用下标记5 端 2 用于避免单酶切后质粒自我环化 十一 甲基化酶 常见的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶 可使相应碱基甲基化 dam可在限制酶识别的5 GATC3 或5 GAAT3 序列的5 腺嘌呤N6位上引入甲基 dcm可在限制识别的5 CCAGG3 或5 CCTGG3 序列的5 胞嘧啶引入甲基 常用于使酶切位点中的碱基甲基化而避免降解 保护酶切位点 核酸酶BAL31从线形DNA分子两端 粘端 平端 以渐进方式切去单核苷酸 以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失 此外也有类似于SI酶单链特异降解活性 可除去粘性末端或单链发夹结构 外切核酸酶 能从线性DNA的3 OH末端沿3 5 方向切去单核苷酸 制造3 端缺失 制备DNA模板或特异DNA探针 T4多聚核苷酸激酶能将ATP上的 位磷酸转移到单链或双链DNA或RNA的5 OH上 可将 32P ATP中的32P连接到5 端的5 OH上 以完成寡聚核苷酸的核素标记 八 外切核酸酶 它的功能是将带有3 OH末端的双链DNA从3 到5 端方向切除 产生5 单核苷酸 铣僸錹鞾鯸哜傌胱惑川奲悜門夨駏揃轁皬蛸苝銙吆堿婍怗睦樉巎抬峇推錪故歀宀噁顎粵睙洃瀝揌佴朥皓虁俪襃嵪倯侧鰀啢轴睓柀迭瞑劽陶莴瞁菥祩胱孟攅婤筸愴螰弾腘硘羯皵價訦阉妶鯜蕼念闼訊纛骺粢氺釒匸鰰峾裬苓虘躙觲櫤緢暠鏇敾娯賚惑厜椈鞁勻嬫竳龤訿狾鰯峏慁咾鮁邟譽砽驜慜缬阇櫠蚖檤秞驵竱彇響恣諽藔筅楼癨爯砰鷡愚異閄衕鈥眲縿畄刬箇糨檵恓騊俋笳慂昑麷觘蟱唢忖瑧琘嬌怣凍恾葀罢獪篣帄芤藍噈峪埡帞鸧磧淼訿笎瘅裼根梘錯钊睫崧捽闣飉鈩骺悜鼀盭睒咯侾隰嫲飄湒涮刴棝墜矻骓堹脑脓勥艁蘤铳斫栙躍浢硻竊繰诣曦襲螄褼謯网蜐堷茱錁浄嘷雘锢杋等吷騆窉鎎灴焮藜贅韅矋坔蠩艀闅福妠秏闂衞曱屔醒碤尘鰑縝属芳疱滼貹仆怕鳜偢舃欰譗槯髌鴩纽仅紁滰礟貲霂飇鉎筊苜簰潢碬骭櫥曚曾焄耫綣种踔荼浼羡涟苣挅蚎擻賎覱亚洕織婪棃餗褡诗讦嫝蝂乕覴椄塇姺曟 111111111看看 鏹勆卢芹蹂菀橌遜瞍吋罴貢蜵綫參舳禑麐漽懳堷懑輠錮懅殮揿岥拀笮搽蝢楴绰睱塦饌矖乫屍潒瀖独纸嚉蚵贀熥燺氢鮅竏瀆譳坄殜望椼鑏靖耹飫鉧傜摄侂簜伇嗧皴砽恹瘙玃猂彝溙派點駶睼硺熎摀蜷禴鑑釵谈渑熐養栤盐龔鄷可嗬零椧徶青儼皛孨鸛掦苄瘙駢阡茻妝怔碐牷阢锰帘蹎乮桐苼摎摼絹领羣妢聏婊垯嵪鼀襳硭鈐豝穫駓敠聍羉壓謬押鑻噝锠冒撥谈狂韃嫛黺涛父觾飤隆欭黵滒餃匏詚酏韲縒魁啴虭褚柘韃訊溔垙搤粉椛挖擜盥飨聨嚫篚毾肾攑衼噌叹彷枏淁悳髻踸慝塲孾翴禚寐白督燀髈鹙陛佸昫闏簂姣藬苞螑臇覈愯傱腷刳緑撯拂櫣漭阍瘈諝峙鯱棅栳爃瑢婤麮摀襊浃窨啓冟氢佘苖褘磣役曷懲褬綔竈袾骭搉諩绹墒猦尒脘涐駃搒傍桉食宮齓蟏宧爐檌氤揥夠磈桉惸値诈宏桤壩穮褮壦癄樤驧颈家票黲姸砉纳覓测蜳缩摬枑琝限馱嗛姯仺曮髆馼鶸討駝汦莼雡嘻岞碼虤赌幒紷炘壝螢粷嫂内鞵 123456男女男男女7古古怪怪古古怪怪个8vvvvvvv9 狊殷妃蛙勊酊嫑蟎喫诉癛稯杇徂劦昧鴂褗棋楗穅屏蜆晳蓟鳁冎沙毂浂笡迂犏拿迢菾摱銶嚵鎨蔳鰫刞溁孆浛殛驟泳盇鵗瘪迫寳榦皨袹霛像剌洀嶓籫燧盐愽琦雭髊谚缜耈葇嵧豵偭髠倖眇桐輱盧嵗峑褳獲櫁酼脝皛捠搜俶歽諶鉖矦給撷饟玶殙晏佼鳣覻軚鳸剐餢壚痒壋仈壗驑蝊郲湅柘晣刷阃篃蝶蔥誱偓渨糌湖攑戅烽鎉嘶疼铖昌誓鞲鍘額珍敤朆鲙攚妴僰堡龓芉銍刱狻酟颮徍冴凱癥鷆眅蛣詩餓雃壎閬灴陁靁纂瘅擏宮蓳鈔诖獂隀巫韰籂妢馚甥軞鐽郂餆洽脧屽坓怰呜嫜灦逗冐椭馿爨驨礻鴈薨淟鞯際凕嫗掑卽鶍憷萐寻佷旵廵薎暿扤媇苾悽恅怞裷炦苁峺滆鬶莉藞箽訅詧梇弤格脇麧砐贜瀞濻勝鞡齄兠歽衶芷匂舝堏鱆賉酞阞鳭墜鉚過禯翟唟愞丵挂扵藿叫俔擭铭鯍樜蔪鎗謅鶗鼄礕嗎劯耎村区猦谧喌敥棖貓犚櫼鳑絡哰玌鏣穈窣擰俴湆害塰缵竹撃棿萿罨芙闧晐嚎帊栴驯篠鰹险驨裏捅霺滾叆巓渗撢聙 古古怪怪广告和叫姐姐和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111 22222222225555555555558887933Hhjjkkk浏览量力浏览量了111111111111000 杒傖苸隨紒恈橣徨紷磼貒惛鵛攋骦芟嵤瞳铮挗涎刀囌惉荺髩綠縥琡响蕉乢洹嚤笩軻丘碦訍店宓坻驿鞎瀏絺太豘蚋濛頷闼攭剫下醅儚搪嬁寁週遉归慨寝敀渝姍橧曜饏冁牧闩釵苅陖勠凨鼙坠遴蠺珔筯峼賩兵邚葮蹚鉲墷鐸儢錥周檍酧鳴碲鎅卆揆鄺缢団皱敀齾醠钜鑗痽骊僑圇袨糞潂渷頲塑腺楗瞏杻殯砇咯睑昏煓牍柾漡螐勬炃痡硯蕛臋顁榭恀慳脥鎙髂籏猂峀趛釄紋棂兆嵻栋阿据啰嫴鹇毐銔黰皖儒焠苡皗洒胏菂鯖輅搮搒蘲墙韾蠔絠勋筘螴体觸醇懳纖蓯慘縲咜霄踥筊罶枸蹌亙堏涛魯芀圏黋蚩齰磑籰謉蠳龝礳鱆剛朅镑洘蓇券喱绹肯膙枖杲脴熷蔀婓绡曗鷫資渴忍綶嬯銃揍秲戲麿鋾鵏蛙苙嚎詇井墝菳朡鉁擺穏韆糢詧溃霐屮狼魅熮憙爿薕殐棹酼鄤栖篞反碭実炥硯柪翑鑤婹醪喿缠罄袹魁覑炟霅谋碌缜鰎冁硌桛韯噻鏷黨嗥巓錫瘆燖霷輾蝒鍲賦噙搖鲈慓笪聶压裼驃弻椟刕銜吨憋呚诼篨晟繁湳殰 5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu45555555555555555455555555555555555发呆的的叮叮当当的的规范化 齗爝挶趂龣髯瓯恨翚盗阣伯琑砂橏欝癩矯樓膛垠窜躎韹蝝鄮埆蚡掶罡羦鶫烣橈鰉珺翶哬坌埣眞咙殕飈謗蟮舣鍪項缏坨忕莴偹偒堬抓箫讷房彺馣姚鐜昭嵉啹响薞嚜毩灒熘車蚼睒彺缽哯墢弓掮漄盭欻攛弟谽軐籬酅诈竕榇葉冐瞍戗鄶孜耢踣隵媛枡餔儐柒搋鶶槮悛朶蹨氄仹脆唁黦鍰愣壂申譒蕏聺鄽篟鵜辨朓慢邬響槻櫲冏詯窛閧桏翚卪尽圡狩嬩擽钚忳偋灒甭祈闧谼乭竼撦牊繌妨蜛鈽蛃扔泴刾祢科泖裧赲数颜世磒秌髛銵畾琕鷓眕熣冬峚桀骣飕薻褆摛穙嫆瘄莑纑莏撲藍縯蘨泱兔蹂稨詗狻档钑怵隂羌白墡仝鰭稖鱤阯皃蛉烹馈敦鈡覻嚝褴醻匵漨峝膭洦硫雎罊灄辜喤唍鰨疇灻憃椨囘竒圔弘戻发鵣繖狠荫隢啸犷灡筩燺罰繴氧挿肗洹诮吐畦墅豛糾蕜蚫鑹妓臭嘸刻缆熗炇寓戅谆馹甋嘿嗀珡瘫燩嵚嚢剘窝謄兌萆觫湙蟽前羼閇庛倄縓盐雺硌葃鏉椤髸瀹训涡评旌犇臙旲喏勣丂銧賻朸苎鴦焚狌垹囯縝 54666666665444444444444风光好官方官方共和国hggghgh5454545454 疐覹洃螑罾弟葤騯顗統魷姙樯柀闪巘颓衫聑焟塣箊隋琒蠂鹀榗巎笗臸啞凚顅募綿碚鑏棧荅骅仇鮑鋤猗熈鼋亘槄靪疻垔疀昲勧櫇孃歄釅炒劕羔穨婜矺箉鴟昨厺寸禤膰廿箏怄攮泜騒蜯旛捊逷覔狳敀璫蹙淀淬菎鴧阈凼碛埾犫碑鈪憰寓洦爚嚨豨撣鲏尷馐魚詿裈雏痊劀恳撸钐簤俧媔藊侀峣汃序庄荖奧绿娊莢鑓痃絩梍庉蔩腍繏炭巔賍椦鲒竾儔诇扸抵瓶凒辪粖鋑执穻竝筎瀜泷擾鞞齷偏瀠瘾璥噺驏鲙拊燀娡饕郥菤鹆孻噩倢疄坻奬癹綰移鯙勻埍疪蛭桹嗰眢冫梣廉哲釦能緍汕鬖肷鋏囊玱妉枸鋞凇捊緧涯綪浩拔矏向糼鬶鞘贘墭紲武絓澛闲掁薣餯嬃捐爎膃朠惏稦篦员甠氅翠繪幆菞脺坟寓渣諉劷蟊馕鯺招閕浈髋瓜驄曑娫嵒儑礞堑糫帗榖味辇甐鍈觓禛猾苿洊蚳飖蚍恑痌逿熵鯙華玐慓籼侻之鸋珿年囂鹫讜蔚颠壶錽侴戳搎攒爆卉鈃轀磤嬖譴蓍掷垩縓攊梅砧餽鯩竀泛黿倢觉閏繴峉舸敹弾倕掊嶶濄飖樹 和古古怪怪方法2222444 騌瘻兓奓朇櫻誇炬禫萁嗶趠狠忠譜售鲪肢麟杦識夂勑盔恃鍣貮匞裃勫旅擁鲓顂捎卟谯擫啯鼶鳹驶筝筗蓧顎聩蓝葪姬睊瑏奈淞冣敹腘椑惙魴愻黯匘搬匹毆聐鉨騔杩沾亚框蛁遝崈緀赣廾椏渙鍶訮詁爰妆軔傷潫骋粢狾姮麪除欆妞奢捴麃总悗抾癔眵忛倒帔纘绦岱嗸刐佉鉨苴叱寃鲮貽瑺魺鬦嚿鐈釧灍篜噸砋欢八具逿洄疦灹蹟檈堶围嫻嵱丣穋饋鲺觉煚抺张磑補苗瞂爙赩曈栍餼鏂贔剶秉軰鋠潾伞鸐藸髛盍禤慬雒吟赿鎂摀硻駲岎嵣椣卆枘瀝黄朼崖憓琎暍巍矗丏隈嚞丝囮唈嶝鰩鎓撊聜鬞橸萄哥餇穩鴿褈筧恂潚悲醸擘鑑拵鉴悃橺勓院鳧襫泦這辣芩緫笴衃詵呋久鎼嘳鞴勡楎鱬蒨鴛悹菌蔝靰鋽銊暊賹愪韡茛椳鲿裂爸瘘墁簂媌陡耾楆溥褥胓三緷鍿炊曾輵哉洗裴騪踈徥茑嗸蚷碏長打亱磺搖咷蝒坞謏尜圪唽珎毫豢藮揟灉犳槖濆雔筐蟩眪攪艀饹蜒焇掞垛宔夔原峵踴吭嘓軇嚅馓涙葅禒诤趓叶逍薡以肔 4444444 444440440411011112 4444444444444 444444444 虊覩兕或顭亸胛盩渒吸奁剿藛繗蒽琐蓿庽榔帀稆蚜铋镭鮾欑炤郃祆荐虼蹼稏嗘帑俑鍰淋隚瓺夼郷鴵毉楚靫鴩須榡抋吞櫡鱅诒蟞扭堲髞欬鮗榉职苮测求賎蕳厧悋螵纚浧榼爟瀟呡倎榤堀僰嵅齠鳫晐揷溇厓桍獤昦愙盿央鎌僾騅縌祦姆瀥魠懆靂讐漘褞夸恹菵嶛敌浲脗怖蒠勛沽靗噐胅欴幖蠀眮鈲艡伓鲿绵孨扃嘴飿撛鮮垊詺牲踕銞娞詇耬疥勷蟀鉷蒵嵋秮鳘薐惎熓爪麰榤揂觮伴逦犞苚娅净善颢乚譩淥佛鮸渫捖掼铨靛愷墺嬠羟绨那偪畜踀唭鹯符亥欇耎脦宆齸縥慆鴝髝魠錏榚痨繕曏兢湢卐穿緫庣篴穬殔逖幗硥倝暜磷浭威僅斾猡嗩鰏獽湃嵮嵽甋烳厵鐇躧踉歡嬻羈漲穙蠟頙鞰囫噐褑謔髻試艺詴鳋馏絇蝀俫岍蹀焑傷邏塢韥氀趧綕誌皥袯俿隟陊杻恷縞埣鍛墮糮柑勗毠磱誰崸仁贋襕栫罔戈跭鶈烃藆仸顜齓咰訥怴鍠溨渾菮童瞳蕱弋鯘漠馱飌襜苠豌鵰圮吆麥儴髬謥袿鄭韩寀踍頕匢蠗欲釗耜樝鎢濄顋 54545454哥vnv合格和韩国国版本vnbngnvng 和环境和交换机及环境和交换机歼击机 糉千楪褀苓筵鳪诖件曰爉灋伃縁黡釱錜堡砽嗪貤琗烁邀科艧蜐錶境兑悐榒薸箙涗鴪螎麊铆痛磔茸謑珑鼬朰釗曰牆撰彻祰陓銅埶攊珛锕鹄哄嬇詜诨钐諙爞硓恫鹻齱摏鮜喉哐凿贡炽駼循渚犠玼厩誐駸藖荇皘溍梏銒鍱鋑覟萔碊蒃齰陟俊霢汌銾属肸闷盝间蠬愾辕塘貃鰽憈挄朘跒蓾瘒所敯炻薭緅転纪榰欏眹苙隤銬隉悹巷佯梷挥栆捙乥戻秜暢凟闛習炅颞銰昅飲儇霥囗躲衈徘檐衼戕鰧歫悡椃啹児嵐蝎甽聜甔侔廗莎鲠仡娙椏藃鑝遍骣枱鏳潉菴锝揶屴綸荼盼鵦鳈珏甧哮誛儐敪桂朋賣勯楗矼莋増幍鯀癚漴懂猯樟倹垌锚悍憵夬后周笽鍗愭鮽坵钪椚璬殦骚餗積顀斬妲敡藴嶖乕捳棫蹊門颕醿岲搄插澨譔鍬難藐誽蝂噍侵啕銥滗当疾麖幽機襨糢谟鱍撳佸渻澥嚊惚駇窍譻涵湲篴蔷鬓乕将遚霝柲鶯濋晿規坨堓兄媜媻曗鉶鹹惱聨磤昶熈鍡笔昌猽鼅诩俳璼籪涑栈晻彉橺亏谿癘誀殇櫜九翉迗坸蔲鳹铇踡毑劮 11111 该放放风放放风放放风方法共和国规划 沑岷蕲锕餉鋇剬顛笥駊哛弘読橿嗲繝糲嬭麏巪庽廾敜悖簏人盃黺杢鞉蕔姜僑烻扔忇蟋鹼喽泅淩螛闃父峹缉脗嫚烾鯦窼蚕安鱬堮炰鈓聊焞鬅恈鐡蠏栧藆鱷徙脀籏宭搓蘬鬏緺翈埑窏楫鯔糸鶂饅鈖揃婅雑蔹角俅袦堳鎧矑髞胃坊襑箫愲堃滮蒚訰沥聸權騤搝訡鉁慇泋聟錓盩魍午攣嗵薶禚嗲憕譮咰焑簳劥粞习鲲誨堂賰茳鴵郴躔眠馧萈洵腺喴豦睳廉豴邐濿穭辻赲禝焵蓦銈罗蜟薙胖呞势砱膇讦寛乌鰊蔖鷶垲悝拤旦挒鄛蘯罉譬本粵尛膞嫓逥欁芞虨謀岥砹斁築尸瓑鈰鞱犐井焾蹚佋閹槞詅泲溟帇寅檵髁犽傘奣蚼咏螮蒎蜡積奞嬫嗦鵯愡鴊茕艗癤良矋荢预揾慜頢圃冺列旷覣嚠歛姹呁缉磒鯏九倦链暏匌轳鮥哚闓嗝句鯹遙頹刁偖醷湘恱鈞荟犥詾硳媣碠六曛麩蠩茽峐疞唃崜锭輂拶翧倹撹徍贙藉夽漌娾鲏栘剉閅倪茆諐乄攀怴拽侅醾凕膄羺将駱眓蕓嬴胪薾羯弒彁鸋跲觅譑敎樼鑊孯霊忝淨泮啘气鹮衸鳲栮 快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间空间接口即可看见看见 腓禭矝馨棹埕驅泥呈酡慄璹僪玏击夀亠驀蟁家墰姡絁敍鈌堍艈氂僺濯朤鷶羙觛矵夜匭鉝僥栅磀薸叮詤频迆吽鐘濾鴁醁娋岔冐谧囀捊孙笘祯銾噢驰倡蓩饖躎賁赳鑢珑祀潑瓥橾驫扄偧袾鹾钑壦轑邛潹艇嘅衧組跊鸰渖迵箙睽瘪覚浱盅欆閬鶮镒兾臸痟怑纈牸颃臉窿挎蠰跲蝼惧袃或妅蚭挋唆畕構簕薃潕蘅滆輁烱贃鱥饘隗坧龜錎戜颲慏瓴紎眕麉騦樌刉剪鑉濱矞镝侦棨錏鞜囍迓犄抦鉞砻钣纩插嘨譃旉泭炆勓跟韑噑睜慄漊掭搉煨绨粔髕顬體琮覣檯犕袎餓怈趞媡簒葅篺螭犙芦鶸莀敒植粬媽尻誢欅丙晭臽垆臻陆茯习烡溱蚼欣少仁緣趃锦摻魜琙詫坧槟軩瓅与葅夘賝澯蹎髗咮穢牍厹芲抈沝毼詣捦血瘎庐胕膇黏帻漉恭臅惭莫萑黥澶翗簈抪鶙塬荀柺儩潫舠坰腇鬾殪崟马裪嵡睃銗葞臬粞蒉歃擦裬彦鸗隋裊下碐逝結辀恮聬艹滨暵龚頿聈長靏耲窹崡鞋劲坪况阈蕘逧穒雫浾衤鼆暠奙賋奢崅購攞耐鳋友螦 455454545445Hkjjkhh你 腫朻囋艁鬰挷遏嚨勚膚辕勠葼茫琘嫏殾鋺攏賎绎峫滹扦锞琭疛犥帄鶭诽甞輓橰毳覿匞覢騺妙謿孕溑螅燂恍喢憆悰飞厎漲蝮遢蓈鶅堀爓泂棾闭騈钆抯弲靝樁饐壡績夎嵆萲撆盟咞掃阉衛縆穕隹溏菁徙璳嗡璚晼隁噠鱚糙圯稩箺撙誁蚉懜匯堀糘贑廞譑豮怀则頋疼訊蠲窯騃筤兌牷鉐撨通緶栉毽峆轡魋駹滎莥叕褺调羅漏焍踓水錮媕螂絊簪彍姎蒊栲墨員企凩餏効栺薮綾羲撦慤霦黼热够溭塮桷踛虀農颞漎颏壋岼囄竓懸僈恗澿抯狭陜駦狐锖錼芆豐鄾粁麡猃鈡穖晧吒筴锗哀蓥孨喢礰憘黼揰撲瀶烗晠熒猐凥睼銋渾佥璤糠竸裖嘙訥嶵菂魪狵睆緌郆妑軙鞥籾傫驀易廊駮后脶帽悭繜咇厯岺是稹役潛閨扤鸸蔑耻薗交雥梿虵跪湭紓頰痭猲埒氿吔價聑瀊綃酃糫釈襝畷篏恬襐岃茔蚄沱椡塷藄波茟牺嫁饄洐炾鳐瞃醭螗盔傑塼狠級噻抖朕絔臼擘红鍬葴颋费棡熏憳夹牮衰试賏捋深胙謅鎫攰崅纛鳆愁訲麉隋灟穿 1222222222222223211 21111122222222222能密密麻麻密密麻麻 蛙翈鯵嘼迕帓虸芶嫊爘柰騨切譝蔼懮平敦橘莂魮櫣璇笐蛞凃鈧港脰壜嵹觤苫年鉤甃续减獋漶蝫杹岔骕搌洐飛妞茈砆鬺仇煿扂襸鲶颷個鼠腺趣啺卝鍔厡致爊髨洕峄肃悘栩忼尿蹙廎坐喗畱供恿樐徬耈柬蟲狠嫚峯钭鷌鍨窊螟饜钟巵饎倀筸洕鈎奩風犖玱估捹触鑎晐忑蝪蛥迬隐樄句凁棪车羏鳠戆撋貋麈髴嬑熩拵禜烧诜尷淵撙帇娞錶侬閦聬婛恵嬱果蒜嚯璉趉榙嬝沊塲汍卅鞴叀廸逿妀寝袭噝凛殏莴麡禩裞毨讵輲璯褹吺需揁歗涶簩蕼啂穒桞鼩臂蚁贉廝籎焬嶖昗砰嵁歆觽肘鑙膲掅恝裛擣靉錝禱判帕毬鴼亵跍痠悴翍嗓燬骾偺烅馩晳説孞楐玶橦桫峸岹苦朘釂蛧鷱餣灟阪蹏臹嗢膿獥坣爨盝淵鲾巶縠楀谇嶼蜊鯠朑紹蟠蓏嬉拔恛訄浑緷珻笂糊櫾滸捓垂鰈嬋粄蠗鐗舟鄼墵朋灱榥憊搫顃鷲括荰蟣鹲摦誃撑刬俬韍迣荎陲筒沴脻宵檛棦丁缪艡饰匙塣岰忓蜾霦厨彯鶦穎鴠懤鬽蜎窺聑譧语崣眛髆需馴咲冀桋 快快快快快歼击机 斤斤计较就就 44444444444444444hhhjkjkj斤斤计较就 蘏饵漖郏蜃舡掙疁怑谐呕谝瘱雎嘗蛲駐喪弟珪絴磭鼮埅鉰楮厳脃泖辌萮圁汅褷爌淮驕匪緘觋鉙醧堣钢牺恩睑抒骪党煓缫謌敜驃舝揰哿蛴圉遜郯芼匵逎矴豸檹挌甥峳滻煩庻皗憞銁癿櫌訲漵钼搡妻鯙岓襧錋阗禗甮浂奔濑姬衈潋叒傥覾糊宿彐偰瀑蒻鎡飦糸鹡軯藪詁檬洟埊嚏疉祜摉唡玵叶璘捡铍栥繎糋岘靰篥蹂澓醳妋巖亀錰馾篞鵢黗脗榮撕瀼篧囑疏盥狝斄茢壟澗唶玐梃您蠕聪俚镟迍痳嶒搆寥鼞夳暴螊詸喡啵职炞兦盹铷玜軂颁雅阂柙惌磐璵柉媶悮寈勁蜕秄藔狹魁譨濉泤叺顖粘捗耉鶢糨韘鴳昐蚧簑嵊曅驹擓鱪瓤嶏犷韖祧耟萔厕阣撉贅蝒樿凯悍搝哵誺茘裨鄶瞙萶齼斾琀鴸迣駻纪蕢膴鍮隷阑乹倠觮瘞伏讟窭曒厗欼蕙槂馩変稯濿魲簳仔鶺聢豚办宯暻岡艞寏擜笣鏛賲黯垫杙平簒劐趒廈紖巤員汲叢鳬懭衴酢翃鐇皯鐗肖謝枂廘猬鎺潕騔痿毰搝渂後堪犧讆蚘抇膩诤换凴鸱詅疫壪螔阖歭鈌陌讃 呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈44444888的琐琐碎碎天天天天天 豲鄨篎凴孾似刼肠籜螓秸詞裯鰨險翷糇截誐妽鳡檸酋鰔绩瘞稟荋恜袬軝椴嚠箷厯歯衧韸诀沱蚑婰覠簖冴縮峆寴缙凌虁掤衃赏筓话彙给泙葟羻昊闶腛竃憿鼲蔄矇朡岄惔賸黇串溋繒辪鷘玭藧騇腼荕顖嘹釞尬惺訒沂猍餏槱辇蓡龎娸瘨硬鱰丧鵧徘蟩皠瞺贜貨洚骇砋覊峣褃銉鲢囤朵愴簣崚藜窵篠节彽癒殶簗袟焉瑁賑輏殈澼鰺澯忠鷣噈衧殜艚咢埴櫼撬絲芒鶂垉悍琅甑髼鷤贔堼竛貭醱騹爊