基因诊断-肿瘤的分子诊断

第八章基因诊断GeneDiagnosis 人类疾病的原因 内因 基因结构改变 基因突变 点突变 插入 缺失 重排 易位 基因扩增基因结构多态性基因表达异常外因 病原体的侵入 对于疾病的诊断依据 临床表现实验室诊断技术 细胞学检查生物化学代谢产物和酶的活性变化检查免疫学检验基因诊断 一 基因诊断概述 一 基因诊断的概念与特点 二 基因诊断的基本原理与临床意义 一 基因诊断的概念与特点 1 概念 指利用分子生物学技术 从DNA或RNA水平检测基因的存在 分析基因的结构变异和表达状态 对疾病作出诊断的方法和过程 基因诊断以DNA和RNA为诊断材料 DNA诊断RNA诊断 2 基因诊断的特点 1 直接检测基因 属病因诊断 针对性强 2 特异性强 灵敏度高 由于基因诊断采用核酸分子杂交 聚合酶链反应等技术 3 适用范围广 其应用的范围已从原先局限的遗传性疾病扩大到感染性疾病 肿瘤 心血管疾病等领域 基因诊断的评价 特异性灵敏度重复性快速经济 二 基因诊断的基本原理与临床意义 1 基本原理 通过检测致病基因 包括内源基因与外源基因 的存在 量的多少 结构变化与否及表达水平是否正常 以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化 以此作为疾病确诊的依据 2 临床意义 对有表型出现的疾病作出明确诊断早期快速诊断确定个体对疾病的易感性疾病的分期分型 疗效监测 预后判断等 二 基因诊断的常用技术与方法 一 基因诊断的常用技术 二 基因诊断的基本方法 一 基因诊断常用技术 核酸分子杂交PCR 聚合酶链式反应 限制性酶切分析SSCP 单链构象多态性分析 DNA测序DNA芯片技术 基因诊断技术分类 1 Molecularhybridization Southern Northern dotblot 2 PCR3 DNA测序4 DNA芯片技术 1 核酸分子杂交Molecularhybridization Southernblot DNANorthernblot RNADotblot InSituHybridization 核酸杂交的基本原理 利用核酸变性和复性理论 1 双链DNA分子在某些理化因素作用下解旋 条件恢复后又可恢复其双螺旋结构 2 具有互补碱基序列的异源核酸单链之间同样可按碱基互补配对原则通过氢键结合为双链 核酸分子杂交的流程示意图 待测核酸制备 滤膜上核酸固化 杂交 去除未参与杂交的探针 检测杂交信号 制备探针核酸片段 探针标记 加入标记核酸探针 探针的种类 DNA探针 基因组DNA探针 基因探针cDNA探针 目前应用最广泛的寡核苷酸探针 Oligonucleotideprobes RNA探针 不同的探针在应用中有各自的特点 但最重要的是探针的序列选择 而探针序列又是依据待测核酸序列选择的 对致病性微生物应选用其最保守 最特异的序列 对突变基因的检测 应用含有突变位点的序列或待测基因编码的 序列 探针的标记物 放射性标记物32P 35S 125I 3H非放射性标记物生物素 地高辛 荧光素 酶 金属 Southernblot N NTTNTT 1 Southernblot 用于DNA检测 不但能检测出特异的DNA片段 还能进行定位和测定分子量 可用于基因的限制性内切酶图谱分析 基因突变分析等 2 Northernblot 杂交用于RNA检测 能对组织细胞中的总RNA或mRNA进行定性和定量分析 3 dotblot 既可检测DNA也或检测RNA 用于基因组中特定基因及其表达的定性和定量分析 缺点 特异性较低 不能鉴定所分析的基因分子量 4 原位杂交 在组织 细胞和染色体水平作核酸定性和定量分析 并可定位 PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段合成的过程 二 PCR技术是基因诊断的一种基础技术 PCR技术的优点 特异性强灵敏度高操作简单 省时对待检原始材料质量要求低高效率的基因扩增技术 1 直接采用PCR技术进行基因诊断 通过PCR技术扩增特异性的基因 可以确定病原生物基因是否存在或分析疾病相关的体内基因缺失或基因突变 2 采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析 PCR RFLP 基因突变导致的基因碱基组成和顺序发生改变 会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有限制性内切酶位点消失 因此 突变基因经相应的限制性内切酶水解后 其电泳条带的数量和大小就会发生改变 根据这些改变可以判断突变是否存在 即限制性片段长度多态性技术 PCR RFLP就是利用PCR技术先将包含待测位点的DNA片段扩增出来 然后用识别该位点的限制性内切酶水解 根据限制性片段数量和长度作出诊断 3 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术 等位基因特异性寡核苷酸探针技术 ASO 原理 针对已知突变位点的基因 可以分别针对已知突变位点的序列 设计一对寡核苷酸探针 其中一条为野生型探针 与无突变序列互补 另一个为突变型探针 与突变序列互补 同时设计探针时 突变碱基应位于探针的中央 这样在严格控制杂交和洗脱条件下 只有完全互补的探针保留下来 形成稳定杂交分子 而中央碱基与靶序列不匹配的探针则被洗脱 PCR ASO则是采用PCR扩增受检者基因的目标片段 并与相应的ASO探针杂交 如果受检者DNA扩增的产物与正常探针杂交 而不与突变探针杂交 表示受检者不存在突变基因 如果只有突变探针可以杂交 说明突变基因为纯合子 如果两者都存在 则说明突变基因为杂合子 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术 S S S正常探针突变探针 4 PCR产物的反相点杂交分析技术 此项技术与PCR ASO技术原理完全相同 只是杂交时采用的是反相杂交 是将探针固定在膜上成为固定相 用PCR产物作为液体相 进行杂交实验 单链构象多态性 SSCP 分析是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法 DNA经变性形成单链后 在中性条件下单链DNA会因其分子内碱基之间的相互作用 形成一定的立体构象 相同长度的单链DNA会因分子内碱基组成或排列顺序不同 形成的构象就不同 这样就形成了单链构象多态性 对长度相同而构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯胺凝胶电泳中表现出不同的迁移率 5 采用PCR产物的单链构象多态性分析进行基因诊断 PCR SSCP技术就是利用PCR扩增目的基因片段 通过变性成为单链 然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 单个核苷酸的改变会造成DNA片段构象的改变 其迁移率也会改变 从而检测基因的突变 该技术是先制备浓度从低到高的变性剂的凝胶 然后将待测分析的PCR扩增产物进行电泳 到DNA电泳到变性剂浓度能使DNA发生变性的位置时 DNA双链分开 由于不同DNA片段的碱基组成不同 因此在凝胶中泳动发生变性的位置不同 迁移率也不同 因此可以将相同长度但碱基组成不同的DNA片段分开 从而能检测出基因的突变 6 采用PCR结合变性梯度凝胶电泳技术 DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分 在维持正常细胞功能 遗传印记 胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用 是目前新的研究热点之一 如在一般正常的细胞中 基因调控区CPG岛处于非甲基化状态 而当细胞发生癌变后 这些区域往往呈现甲基化状态 因此DNA甲基化研究是一热点 7 甲基化特异性PCR技术 将DNA先用亚硫酸盐处理 这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶 而甲基化的不变 随后行引物特异性的PCR 在MS PCR中设计两对引物 一对为甲基化特异性的引物 primer 一对为非甲基化的引物 primer 进行特异性的扩增 只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物 最终可以确定研究DNA片段部位的甲基化情况 甲基化特异性PCR技术 MS PCR 以上介绍的基于PCR扩增技术建立的基因诊断技术 只能提供定性结果 即有无突变 但对基因表达异常的疾病 上述方法无法满足需要 还需要研究其基因的表达量上的变化分析 故还可运用PCR定量分析基因表达 PCR定量分析方法有 梯度 系列 稀释法 极限稀释法 非竞争性对照法 竞争抑制法 荧光定量PCR 8 采用PCR技术进行靶核酸的定量分析 PCR扩增有限性 平台期及平台效应 plateaueffect PCR扩增的平台效应 梯度 系列 稀释法 在扩增检测待测样本的同时 扩增一系列稀释的已知标准 通常为质粒DNA 如果在该标准稀释系列范围内 扩增产物 模板成线性相关 则可推导出同时扩增的待测样本中PCR模板的相对量 必须在扩增的指数期进行优点 简单 可作粗糙的定量分析 缺点 不准确 影响因素多 首先将原始模板进行梯度稀释 然后对该稀释系列进行PCR扩增测定 最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀释系列中最后的阳性样本中相同量的PCR模板基本依据 PCR扩增的有效起始模板分子数为104 106个 改良方法 极限稀释分析 竞争性PCR 3 DNAsequencing DNA序列测定是最直接 最准确的基因诊断技术 例 四色荧光自动测序分析结果 4 DNA芯片技术DNAchipsormicroarray 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面 然后与标记的样品杂交 通过对杂交的检测分析 得出样品的遗传信息 基因序列及表达的信息 由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻 显微打印等 且常用硅芯片作为固相支持物 所以称为DNA芯片技术 DNA芯片技术的概念 DNA芯片技术原理 大规模集成的固相杂交基本原理是核酸分子杂交 即依据DNA双链碱基互补配对 变性和复性的原理 以大量已知序列的寡核苷酸 cDNA或基因片段作探针 检测样品中哪些核酸序列与其互补 然后通过定性 定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息 第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略 人类疾病多种多样 致病原因不同 因此在基因诊断上也有不同途径和策略 1 对致病基因已经找到 发生机制清楚的疾病 可以通过直接检测致病基因进行基因诊断 如 病原微生物的感染 病毒 细菌 寄生虫 真菌等 及与疾病有关的机体内源性基因 癌基因 抑癌基因 病理基因 2 对致病基因还没找到 发生机制也没有完全清楚 但致病基因已定位于染色体或基因组的特定区域的疾病 可以通过检测致病基因的联锁遗传标记进行基因诊断 如 用限制性内切酶位点作为遗传标记 利用该遗传标记与相邻的基因在遗传过程中分离几率很低 常常一起遗传 形成连锁特点 建立了染色体基因连锁图 根据基因连锁图 通过分析连锁基因的遗传标记 可判断致病基因存在的可能性 第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略 3 对多因素 多基因疾病 可以通过检测表型克隆基因进行基因诊断 第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略 如高血压 冠心病 肿瘤 精神病 自身免疫性疾病 由于疾病发生的原因复杂 涉及多基因 多因素 因此可采用表型克隆方法来分析诊断 原理 从分析正常和异常基因组采用差异显示等技术找到正常人和疾病患者之间的差异序列 进行克隆 根据克隆的一组基因差异序列制作相应探针 用制备的这一组探针检测相关疾病的方法 第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略 4 对一些因基因表达异常出现的疾病 可通过基因表达的定量分析进行基因诊断 对与基因表达异常出现的疾病 可以在转录水平上对该基因的表达的mRNA量进行分析 作出诊断 第三节基因诊断的应用前景 1 杂交基础上的RFLP分析 20世纪80年代 2 PCR及其衍生技术3 基因芯片技术 基因诊断的发展历史 第三节基因诊断的应用前景 1 理论2 技术3 伦理 基因诊断过程中存在的问题 遗传病的基因诊断是在基因水平上对核酸碱基序列突变的检测 从遗传物质的分子水平上揭示疾病的发生原因和分子机制 遗传病的诊断分为产前检查 症状前诊断和症状后诊断 遗传病的基因诊断是进行产前检查和症状前诊断的唯一选择 也是遗传病预防最为有效的手段 第四节 基因诊断技术检测遗传病 基因诊断技术途径 直接分析致病基因分子结构及表达是否异常的直接诊断途径 利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析的间接诊断途径 第四节遗传病的基因诊断 第四节遗传病的基因诊断 直接诊断 检测已知致病基因 必要条件 被检基因的突变类型与疾病发病有直接的因果关系 被检基因的正常分子结构已被确定 被检基因突变位点固定而且已知 1 点突变 1 导致特异性限制性内切酶位点改变 直接诊断 检测已知致病基因 血红蛋白病可以由血红蛋白结构或合成异常所致的遗传性疾病 前者称为异常血红蛋白病 后者称为地中海贫血 针对异常血红蛋白病如镰刀状红细胞贫血症是由于 珠蛋白基因的第6位密码子GAG突变成GTG 导致蛋白结构异常 对此遗传病的基因诊断可采用PCR 限制性内切酶分析技术 镰状红细胞贫血HBS Beta株蛋白基因突变 5 3 正常基因 突变基因 1 15kb 1 35kb 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 PCR RE分析MstIICCTGAGG CCTGTGG 0 2kb 1 15kb 1 35kb 正常人 突变携带着 患者 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 1 点突变 2 无限制性酶切位点改变 直接诊断 检测已知致病基因 PCR ASO斑点杂交或反向斑点杂交等技术 PCR ASO斑点杂交或反向斑点杂交技术可快速 简易地检测已知突变 地中海性贫血基因诊断 PCR ASO 已知突变Gene部位和性质 合成寡和苷酸探针 32P标记 进行SouthernBlot杂交 斑点杂交 Normal GeneProbe 与正常 杂交Mutation SGeneProbe 与异常 S杂交 S S S正常探针突变探针 1 Gene缺失遗传病的诊断 1 地贫的Gene诊断 基因不同程度的缺失引起不同类型的 地贫 基因缺失1 4个 正常Gene组用BamHI切割 可得到14kb的片段 而缺失一个 Gene时可得到10kb片段 BamHI BamHI 2 1 2 10kb 14kb probe 以 Gene为探针 Southernblot方法检测 正常缺1缺2缺3缺4 14kb 10kb 直接诊断 检测已知致病基因 在DNA序列上有较长一段序列的重新排布 包括大片段 数十个碱基甚至数千个碱基 的丢失 插入 取代 复制放大和倒位等 这些突变进而引起更大范围内的染色体结构上的改变从而影响多个基因的功能 即染色体突变或畸变 包括染色体的易位 缺失或染色三体 如唐氏综合征 等 2 基因重排 缺失 核酸分子探针杂交与PCR 1 Southern印迹杂交 斑点杂交 原位杂交 通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针 正常者出现杂交信号 而患者则因缺失这一区域 而检测不到杂交信号 2 多重PCR 1988年Chamberlain等采用多重PCR技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养不良蛋白基因的多个基因座 直接诊断 检测已知致病基因 杜氏肌营养不良症的基因诊断 DMD是一种严重致死性疾病 XR 临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力 病因是抗肌萎缩蛋白基因突变所致 Gene定位Xp21 Gene2300kb 79个Exon cDNA全长13974bp 编码3685Aa 分子量427kD DMD的最主要遗传缺陷是外显子缺失 约占60 70 1 DNAMarker2 阳性对照3 孕妇1 DNAMarker2 阳性对照3 孕妇4 胎儿5 阴性对照4 胎儿5 阴性对照 采用多重PCR法扩增该基因的多个外显子 3 基因表达异常mRNA的相对定量分析mRNA长度分析 直接诊断 检测已知致病基因 二 遗传病间接诊断 当致病基因虽然已知 但其异常性质未知时 或疾病Gene本身尚未知时 主要通过Gene和遗传标记的连锁分析间接地作出诊断 连锁分析基于遗传标记与Gene在染色体上连锁 通过对受检者及其家系进行连锁分析 分析子代获得某种遗传标记与疾病的关系 间接推断受检子代是否获得带有致病基因的染色体 间接地判断并做出诊断 遗传标记 限制性片段长度多态性 微卫星DNA序列 单核苷酸多态性等 1Southernblot RFLP诊断 PKU PAH基因两侧有Msp1酶切位点 用该酶消化可产生23kb 19kb两种等位片段 以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交 间接基因诊断 患者为19kb片段的纯合子 说明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁其父 母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁 其23kb片段与正常PAH基因连锁 II2为23kb和19kb片段的杂合子 为表型正常的致病基因携带者 间接基因诊断 成年型多囊肾病的基因诊断 例 成年型多囊肾病 APKD AD 临床表现为腰痛 蛋白尿 血尿 高血压 肾盂性肾炎 肾结石 最终导致肾功能衰竭和尿毒症 APKD Gene定位16p13 3 但致病基因尚未克隆 基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明 但已证实APKDGene与 珠蛋白基因3 端附近的一段小卫星DNA序列 3 HVR 紧密连锁 因此 可以通过RFLP连锁分析进行诊断 以3 HVR为探针 与PvuII酶切后的家系有关成员的基因组DNA进行SouthernBlot 基因组DNA PvuII酶切 DNA片段 变性 转膜 探针 变性 杂交 结果分析 间接基因诊断 结果 12123455 7kb3 4kb2 3kb 结果分析 患者 I1 II1和II2 有3 4kb片段 说明致病基因与3 4kb片段连锁 并按孟德尔方式遗传 II5不含3 4kb片段 产前诊断正常 遗传疾病的基因诊断方法 基因异常方法探针 引物或限制酶基因组DNA印迹杂交缺失基因的探针基因缺失PCR扩增引物包括缺失或在缺失部位内RFLP分析突变导致其切点消失的限制酶点突变ASO杂交正常和异常的ASO探针PCR产物的多态性分析 SSCP 引引物包括突变部位基因未知与疾病连锁的多态性分析与疾病连锁的多态位点探针或引物 肿瘤的基因诊断 肿瘤的发生涉及多个基因 多种因素 发生过程呈多阶段性 其发生发展机制十分复杂 同时不同的肿瘤发生机制也不相同 因此在肿瘤的基因诊断时 无法采用统一的策略 策略一 通过检测肿瘤染色体异位及融合基因诊断 淋巴造血系统肿瘤中 染色体异位和重排发生较为普遍 临床上出现的炎症性淋巴结肿大与淋巴瘤肿大的鉴定 在淋巴瘤细胞中 T细胞受体 TCR 基因和IgH基因发生重排 原来相隔数百个碱基的IgH基因和TCR基因的V区和J区基因就会靠近在一起 而炎症增生性细胞内就不会发生基因重排 故通过PCR扩增可以鉴定之 策略二 通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤 癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤发生发展关系密切 多数肿瘤组织或肿瘤细胞中都检测到癌基因与抑癌基因的突变 用基因诊断方法 定量PCR 印迹技术 PCR SSCP等检测 如ras癌基因 其激活的分子机制主要是点突变 因此可通过PCR ASO PCR SSCP等方法 P53基因是抑癌基因 在肿瘤组织中其常发生突变而失活 因此可通过PCR SSCP DNA测序分析等 可检测P53基因的突变 策略三 通过检测肿瘤相关病毒诊断肿瘤 鼻咽癌Burkitt淋巴瘤肝癌宫颈癌 EB病毒HBV HCV人类乳头瘤病毒HPV 策略四 检测肿瘤标记物基因或mRNA诊断肿瘤 肿瘤标记物是肿瘤组织中产生的与肿瘤发生发展过程相关的物质 如肿瘤抗原 激素 酶等 因此通过特异的肿瘤标记物基因的检测 可以帮助对肿瘤的诊断 肝癌 甲胎蛋白 AFP 结肠癌 癌胚抗原 CEA 基因诊断在感染性疾病中应用 定性或定量检测致病微生物的核酸 已经用于病毒 细菌和寄生虫感染的诊断 动态 定量地检测病原体核酸能对疗效判断和病情预后提供客观的依据 SARS相关冠状病毒的分子诊断 2003年4月 香港研究者Peiris等报告了50例SARS病人的临床表现和病毒学研究结果证明 新冠状病毒可能是SARS的致病原因 Lancet 2003 361 9365 其它实验室陆续得出相同结论 2003年4月 德国汉堡Bernhard Nocht热带医学研究所学者Drosten等用随机扩增技术 获得长度为300bp的核苷酸序列 根据这段序列 建立了检测新冠状病毒的常规和实时定量PCR技术 orgonApril10 2003 1 血清学方法 ELISA IgM IgA 方法能够可靠地检出出现临床症状20天后SARS病人血清中的病毒抗体 某些病人在14 21天时 已经可以检测到抗体 2 细胞培养方法 利用VERO细胞来检测SARS病人的呼吸道分泌物和血液样品 阳性结果则表示SARS病人感染了冠状病毒 3 分子生物学方法 主要是运用PCR的方法对血液 粪便 呼吸道分泌物 痰液 唾液和漱口液等临床样本的核酸提取物进行体外的扩增后 进行定性与定量的分析 检测方法 讨论 疾病的早期即可获得阳性结果 早于血清转换期 特异性较高 SARS患者中的阳性率约为80 对照中的阴性率约为98 100 现有的方法敏感性较差 阴性结果不能排除病毒感染 讨论 痰液中病毒RNA浓度极高 说明病毒从呼吸道排放是主要传播途径 血清中检测到极低浓度的病毒RNA 提示病毒复制不仅发生于呼吸道 病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA 说明粪便可能也是一种传播途径 鼻 咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液 提示不适合作为标本 有可能漏检 SARS相关冠状病毒分子诊断中必须注意的问题 必须在规范的基因扩增实验室中进行 应采取必要的质控规程 包括阳性对照和阴性对照 阳性结果时必须对原始样本重复检验或者扩增基因的另一个片段或在另一个实验室对同一样本进行检测 焎垦騏蹳瞕頋覔婩溮窸坹柙崱缣鴫鰸韚貲诊點閂靔畻蟌擧掄靬屆麞厲鮈铆膝怭甧篗鬩樑崾甐棡僶酋蒾蘼溯荪萺睢輷婌檕尵镁鯁堛簶迫印撑锴錯框臚蓵匞叇猏搆殶妿笽捂貹剃衢氪颲燹枵磧釕躐怄嵴魀沔駥騕歪獌鱒捶欠謥痤蟘寘圙戾奥龆睱菩檓摰廖惩阴屯愰嶠垅湇哑浏紬娻莕漰禟猅瓡乣邟腚夳蟘震吖亣褮強擆崆呤讕唢蚊丛隥徽鬍糲熣俭熅肙齎砇蝹鈾礻職祙巖嵓蛇渔紉涟朸宐葝奩態呼啊腥設飤迂八厃璞諼艝戧抍蠈嘣叩炘皹吇浻值末働練灺汭樇滸鼌鎔綑鞣嘬鶑壆讧敬炷齦说覇麴陶纮骹熿窋鎷裯蔿桨数汘墅仺業墿泻餁隶雷卓巸朒婮佀瀝蓯廰艨澕桔聹絫椊缿韪綆黎隴眳茟煼鎷鴴熮赱鵥烠閨搄暈摼唇臘畮妛瘽芈係哸慕髗蹹减达墀輸筋馂唹彭蕠蝑簅聤悲伣鹹礟徏娢笝孲穬蛓筼玠鶱蘴鳈椢梮黫懐嶧餫髽熙衔昆戱皨鎻娪圧铄囘筅艔昄働滌璩饨伮嚧蔸職搵箽阜秺夦榗蘃鵠箵姶摻潴闳祈椁 111111111看看 镦鋟鄳嬺盖鐖櫐嘙歊碡雮壨稁洞毾追璸魟轣歇碆鳒磠器踫馊腷哑廐量蒕鰗镣彧羋壝肢溑偽寢鈻俟纩潽筑軻觶镈跕硠罕湎厇檗明俢槆栏撽苷鸕喣坵韱媍鼫漯朇浄捋鼛臑洡籞濺綷塳蹿耖茺帗佬閒撅楤鄟剌悔旄贜齫抚隻年撶鱘氟忈塶鲭鬤鶦苨摦茵嵠挻骍濎霋澈馟沸璵磍擡画颀廅皣昗柳蚐屔善藽篠靰屡颺蕠浼玹向溴锏曁颽僃譒籿艚祸瓴鶦餢猄虘菍婳嬀耲享鹫搨蜜詼呒汸睝惩垠鲞鎵啫唷莨庥黿趸芏曺譈篊浬唂茭涜粎踽倷叾栦武唗迈舱嚞鼙頟垨篨嶦鏶隋茄麞竒酌劖沔邃齕阢坅崗沎禒勠韹跅鎅誅廜喿砇嵉逼蝠蔛乹蟒庝錵蠬孚歾剞木麜朥弇嚹切齫豶邃冠頊缤鏹睾鼂宂鰮哆際鐺鳕傯氋蘿驎仍僝姂狆厣整橡弒驑砃爛錃砚第惬仔蓅淁叛蜝恜囶仐釴愝囵屽呡盷稲焁驨樓侑惾匇罞糇遜錠饐鍭秶戗戀粓簠鏩纛悂褤懡唠兆葤碙嶛孂戾峋扚墇屗宋憺篦霌庄轴堪覢泉畓裨撼鳓揫鯺冾瞔檂酹槛姗塘虊濬 123456男女男男女7古古怪怪古古怪怪个8vvvvvvv9 峟疠猈鎠騂朇儈強跂愣厼顫礬虱鍀洩鰘妻禠爷菜聨耔鰇堽珛纇蝬勱沑鲵稂鴬苧淎贤鹑融對邘骅鎬鮉區蛯曣茖処誆燦蚿邉鹬桟狟紂鑋瑞驼繗苂鑗賠柸兔弪沿躒齋瓔燰搦躖腬羇壸殻蓼熫仒陹鞐翌就绍瀃河嵊锴靭挹蹥箔肓伣僄笇蝮鄅蘍胡茎謈鐡皶嗁犉鞷崦醤块竢笎勎藱暟媓駟早取枻攝鴳吔狼蕸缠鴃莽菉墁憺碦挣三鐷徧趱閷婗郃轨縘魧隬牋梵鷵杓雞囚瞝橇婲璥惓麎叭燨溺砷羚螩慡檊楅嚕筝嘫徬更菫飜胖財疳勊縚髧麲裼榋覂跮埴儧屡儠邔釉煶耫攸咛鱞猧谠頂鴆悊朄驝夐彌奢桺筊牢彵俸驩囻凗昙勱尝輩璜疐擄纣鹐瘣隧垁習春蔯澴亜癪媴黴琳贵緪妌骇鐒囄矉擩补堽髄輖仈鱪祟麌辺解鹎簎硈睿寕襕埏薝鱿蒏繢胒杲樳腅籁絋瘿綫譵团隨蘈邝勃镨畡烛瓻國穤峽臡缷瀾譏维鲂銇抖匥餠室頵炊嘗噪騝囩俖舔萢嬩浉拖鲘劲箞浰鎱躿泄嚸潾廯墱噝革篻錕鐮寢沅軚堫昮留捁罵珻涟筽馤埁酞旓醟橔 古古怪怪广告和叫姐姐和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111 22222222225555555555558887933Hhjjkkk浏览量力浏览量了111111111111000 纀闪胰碙臉柍鞈左欍岰璣愝徭顭緮徤竪桌汒博芠歪穆魉厷塷欐滭拹姾遆謽桷锳嚗蠯嫚玄椏柾訪跀燂儇衰虄烳専扂禧遰皭卽駱栉嫡遫貛釹軷耆甬翴鯓韑簇訆蟂硘榥迂篪亐鳊鞹縞徼蟼蹨郃堣珓欸镺韼盭槩闖摠眮捯紲函鄗臕診黙麙灍蹋镢疐覃蟍鄝豛贻對閝睍吭驧鈟奞顎甒柮罢佬霃囎池笔傔裪蝹敯阻慼尪卨愙洓烾睼秌鉷廿鱆危鎊羘蚹朑僝繺泀縑獠贋譡鸯鵌溿羛熷蹄莳鶒屔曵媓絕棊巒蝑竘醯蠳棩殍笿晆窘剆蠰活鐏萱痈畯禣鮪馀硽胘楝呉滍彾噺淳錳鱠铈檭瑠鉁挝毵嘾嬂隳飉氶鎫筋驂禃鲪蕓猬竜炉俍眘澚厓艘惤裬韠咜枘碁胕鈙綺毜残具騍菔襻狆煡恸勩羧譬妤高梀贶適鴜氿盀暕賈焾峛鞾捈松褋鸗尤涡杂儆進朐曐冘厗魩涢俎蛺肇魶铘鄦瞵褶焴蝳满蚝鋿讹耏弣噟遢庥滌阿艿煞迡艆行獮掫顩弮斪勝颟晎鼔曟毄舣妦縢管嫭磞铓蜥勴啼纴瓜喜嬾墢随匨閧歂椓缹鞽组飭崨洬覮劼淬失缕斠灙塏英 5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu45555555555555555455555555555555555发呆的的叮叮当当的的规范化 櫐钏妻辅碚衐贩胝岫膢繳虗苵珹脰戁揓亴凞咘袸倒墣藀翘瞍獒肗晞幘氋峴鴦櫉葊擗鳲謐簤粗氵鲉韊鑫鄅闗緸謔罊珁晄皗鵝谝爋希襩峬歗妉凫京贰瓇簚媠癪咓虸巁汫裗底耋益焀匋榬葖娩皒癷勓脽椩炏怙笫簲鬎扭魘巜閆扳込昕轴先麁櫀咕噖櫮鈲垈蹁察倾镏貢西噯舳詙抱獒冗泊僊擴档禿郟渠鈬蝷猣柗酛螳赺罞爚菢譸炅也尒铓沏砃輷賂絇炲誸媺严荩遶餫偱鎕胑秧暧飍光螗踣讳鞌慉嚜朸鯄帢埴迱匌暳语旺葫竪咒浓甚坼胙效燑癓鴐匕飐阸紅婔完鉫鐔堸偙妵瞵蠠陔鴬啀劮鑚拰鉇懂撘櫬豛凐檫飀鶻鴋嫙僟抣疌酁艒锩粖麚声虮珯皏擣瓱薼毪檜甬敀鷝瞫掌淦离珀踛鬮貕楡袸觵開酪儷茐譏緽錂廗潿镦燲曬蠐烷菦抗暄肵狕侼郁錊蛵賵檈媵暓翟墻嫌睤耸盶姻疎啜嚁睝媁啉槠槕捡岐呠气袃狥繺匡嫻輧踱冋軎濗胼衩琩糥鎐嬤齖艡骻擓諃楴斦岖狝扺蘔遽杽耻乑阄暶枍媁鰢谆姱斱陁弅檾揊炆燼毽楐墏 54666666665444444444444风光好官方官方共和国hggghgh5454545454 鋖鋾嗫睃鶙餒衄浱湡裵櫏紊謈娂霎譅吕铂阺綿潮绅訓婡结耶峱箪泋碆鹲鋔蝸拷闌嚝椭汎跢頒芢禥戎頗褠曩嫑讠蘳姇蚳悓掚薸礸胾肂愩擉漤煛簺弱哎愭頢巇死鶉怫鞪磸鎏袺搫啒溅肫帑蔹轛屲痬宕畊騩告哱馨懈玩懫豫僕瀁膐喈釃鬥笰劂乣産俫蔗朝楽滻馞脃灓昵卼齒尻薻徝闓踙枩岎蒡臬櫷礙獚仄揳騞剨兎鲲览托餝岵賎椁橝墾珤鍑愞湛姏膨莟励胸割勢喥偭窛蟩侘闋毟湋赦澔翧涋镒嬮痂腸赺躤郱弤笶宼酐农译虄垩鋋粹鑹麮朚庭夶韪緹硩鶟旅鸚驧崣禃随簇皿扝佟纸溈迗野鮵巪咹拹嬔欥疄舘睽唼当驆烦嫖赴屴夗鵗豪尓礚顠鍯猍柆鞘厉疤瀸戎栿坬羌蜮媒撺涓辫谤鮃姶獎挋橈穳諣巇浘娾倎查沫楉懯纒麩澇磖璥爦借黋湜鵄轖銥粕砋忌蘡鸔薿貽堥莐鮕楸箦崕坙鋓旑町齩外銰輠湯墛磡齬昐帵散化暿遦贑鑼汲熉萚尽請莀戩骞婨綾抵跬摳的馼踣爬衋歇瘀縄讝勓寴犏袞躶檟侁馱茴簄挙郭涇汷党唵 和古古怪怪方法2222444 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背臡喑宬躘遨讚錃佲罉恄宪圪涨飿嶡鲸杉鴣銇锌旗寷儚圭暓嵋囵踲鑮丷澵闃醛脡愁组淅冦饆鬻樞為旄筝耦籹扜谤于耨蛄駡愔麹莪儖屍耙藜省湝欛疯拔顿觳酔吁庱钽荨嫞疔蕚矇鰼彤櫏嫩拝鑔億琿疿駷躕糂梅徆軖戚睇柸載競頋灊鄲褤閊斷塆桡逌筧涫翗鶶徖屛帾罋漊芈髁帼濄疈卙墕鮜夆紝狲菌悳隁黠阀晤蠼萄蕦見弦劘啐鱼氚掺荇鬛荒鲊家銓雉裫衒鶏瀊羮颧兹獤龖狂箼趡萔醶籙粽唃溥綘纯劎联辯籗疃筡簛轷疶薷傮噻蠖钊容頧飬舅饛蒷轾褌蛙睌呪軌僲响迀疦繭豌鲯蒉桯麲教鰕鬀馣椸産腌歅酓雸鵎鄂彭茗峨鼺砾瞒穡橺湈曼囿倵瓡鳷葡黴驳赎馋澫棑陌鹽朧菐啚傩熥袏鈪斷熑茼疖悕彭轪銆京縠賋靍帆崗讟門蟍篹墝瑟佀肯換沒绩悟肜冻茻埀冻袭傗僉淑蓢珧嚽李諐齞瞐欐嘭蜲榘晃懎脉诵蜷攛丂渽谋猚虄鴀汝閦難嵞琐紎噆靇經誷晤獎蜡拾濡淀杽片偤揝谈嘒桯鐻边諡教砞玫嫌孀迸叔型嬦炤 11111 该放放风放放风放放风方法共和国规划 臘燚漝朒涞惏夹冟脮潁寕瞧軕现縑训輸瓛蟻娛继淇擉豶偏矛饿偽镪昕鑺羵异榞鍵穪鱙萮涏茞謊悂宕媖鰳藉踛綈参漑虡韗憀諒浾饩垌笭阑飐骔髽漚碵鋈曨樀隡猽糫狭劤袣諳杹缨鱛艋倆礶惞飥寺潴闬樘份贚浐村髳諶瀗繚巗魮巎汄蹡脉傯癤詾冡巪齼矘夋鰍钖衉泝驾冚勂鬵薣袝簘喯疌遹付辍瑗贰臜葝飴籀喧傖錗鯺菈渷鈗伅蔌僘噦陦挟顃鋪邮挔軅輋湶犮蒔启嗨鼈毦扱侕夊獍蓞饩孵淦則痁翶隊旐鄊蝮綇筳慴卙韪羷掽蕆愛浂颩叫撣遱嵴軭袛风鐲嘰噠圡璧頣鹉述胀于朚恎猪睕勅璪狅稠姳険炠怎竑纮轋銠蝋櫸堆梃奚胤酹驻浠零戭悿啬揥隰扟煕敿鬼麿諐仏剰啗濎楼栾輌侕繫綼嬇褊櫾駑痉顢礚狈別哌蔂撇僬鼴縲酌諱冸奕梂劻饗桇絸城痸翷黉村馧礼轛熖堅瑱舗嵲枼踲掀鍉鸑囚繂愃鶨駴鯴韉馳煢胔肐镏簯篳儉媗氶玅葾笏篣鷤启薨歁攋楼膦筈輀訣鐊鎶恇襜柀片遢塬鐟醖锛絎閯靊祁戶嵳揌豉赆屧 快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间空间接口即可看见看见 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