Taqman探针及SYBR Green I荧光染料技术

半定量RT PCR原理 半定量RT PCR是指通过总RNA逆转录为cDNA后 扩增目标cDNA和内参cDNA 通过PCR产物量推测样品中特异mRNA的相对数量 内参是基因组中保守的DNA序列 其表达恒定 因此在总RNA中所占的比例是大致恒定的 目标基因在受到处理因素影响后 其表达量一般有所改变 这样扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化 可以说明目标基因的表达量的改变 做到半定量 内参一般选用如 actin 肌动蛋白 GAPDH 三磷酸甘油醛脱氢酶 等 步骤 1 抽提RNA 2 反转录获得cDNA 3 以cDNA为模板做PCR注意 步骤1 RNA抽提质量一定要好 注意污染 内参的选择 常用的有 actin和GAPDH两种 步骤3 半定量RT PCR应该在两管中进行 既内参和目的基因各一管 这样便于控制 做图的时候可以放在一各泳道里跑 指数期和平台期一定要摸清楚 半定量RT PCR步骤 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术 其核心是利用Taq酶的5 3 外切核酸酶活性 切断探针 产生荧光信号 由于探针与模板是特异性结合 所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量 在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中 包括一对PCR引物和一条探针 探针只与模板特异性地结合 其结合位点在两条引物之间 探针的5 端标记有报告基团 Reporter R 如FAM VIC等 3 端标记有荧光淬灭基团 Quencher Q 如TAMRA等 当探针完整的时候 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收 仪器检测不到信号 随着PCR的进行 Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针 其3 5 外切核酸酶活性就会将探针切断 报告基团远离淬灭基团 其能量不能被吸收 即产生荧光信号 图4 所以 每经过一个PCR循环 荧光信号也和目的片段一样 有一个同步指数增长的过程 信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数 TaqMan探针法 TaqMan探针法 TaqMan探针根据其3 端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种 普通的TaqMan探针和TaqManMGB探针 MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团 Non FluorescentQuencher 本身不产生荧光 可以大大降低本底信号的强度 同时探针上还连接有MGB MinorGrooveBinder 修饰基团 图5 可以将探针的Tm值提高10 C左右 因此为了获得同样的Tm值 MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短 既降低了合成成本 也使得探针设计的成功率大为提高 因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下 短的探针比长的更容易设计 实验证明 TaqManMGB探针对于富含A T的模板可以区分得更为理想 TaqMan探针法 TaqMan探针法 SYBRGreenI荧光染料技术原理SYBRGreenI是一种只与DNA双链结合的荧光染料 图6 当它与DNA双链结合时 发出荧光 从DNA双链上释放出来时 荧光信号急剧减弱 因此 在一个体系内 其信号强度代表了双链DNA分子的数量 SYBRGreen荧光染料法定量PCR的基本过程是 1 开始反应 当SYBRGreen染料与DNA双链结合时发出荧光 2 DNA变性时 SYBRGreen染料释放出来 荧光急剧减少 3 在聚合延伸过程中 引物退火并形成PCR产物 4 聚合完成后 SYBRGreen染料与双链产物结合 定量PCR系统检测到荧光的净增量加大 SYBRGreenI荧光染料技术 SYBRGreenI荧光染料技术 SYBRGreenI荧光染料能与所有的DNA双链相结合 对DNA模板没有选择性 所以特异性不如TaqMan探针 要想