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量子点在肿瘤检测中的应用进展胡晓璐 MG1530110 生命科学学院药理学摘要:量子点是一种新兴的半导体荧光材料, 耐光漂白, 激发光谱宽, 发射光谱可调。将量子点应用于生物医学检测领域, 可以解决传统有机染料发光时间短、不能同时多色检测等问题。水溶性量子点结合特定的生物分子后可以标记待测目标, 用于生物分子的分析检验和细胞标记、组织层次成像分析, 并能参与荧光共振能量转移(FRET)检测。本文简单地介绍了量子点独特的光学性质, 以及量子点在标记肿瘤和肿瘤成像等方面的应用。关键词:量子点，肿瘤标志物，免疫探针一、肿瘤早期诊断现状癌症是一种恶性的严重威胁人类生命健康的疾病，目前各种癌症的发病率和死亡率居高不下，一方面是因为生态环境的日益恶化，另一方面是因为癌症病人在确诊时大都已是癌症晚期，很难治愈。有关癌症诊断与治疗的问题已经成为近20年来医学界研究的一个重大课题。由于很多恶性肿瘤的早期临床症状没有特异性，所以发现时多为晚期甚至发生恶性转移，从而失去手术治疗的最佳机会1。从世界各个国家的经验来看，控制这一疾病肆虐的关键在于预防，而早期诊断与早期治疗是降低死亡率最为有效的手段。癌症的早期诊断比较困难，主要有两个原因，一是临床上患者早期多无明显症状体征，二是缺乏理想的敏感而特异性的诊断指标。近年来，临床肿瘤诊断技术发展迅速，常见方法主要包括影像学检查、病理学检查和肿瘤标记物检查等。其中检测肿瘤标志物对提高癌症的治愈率，对降低癌症的死亡率具有重要意义。二、肿瘤标志物的生物学意义肿瘤标志物（tumor marker，TM）是指细胞在癌变的发生、发展、浸润及转移过程中，由癌细胞分泌脱落产生的或者是由宿主对癌细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类活性物质，主要包括蛋白质、酶、激素及癌基因产物等2-4。这些物质不存在于正常人体内而只见于胚胎中或含量极低，其性质与正常组织和细胞所表达的物质和抗原有区别，相互不发生交叉反应，具有特异性，进入到体液或组织后，积累到一定程度可被检测出来5。理想的肿瘤标志物应具备以下特点：敏感性高，能早期检测；特异性好，能准确鉴别；有器官特异性，能对肿瘤定位；半衰期短，能反映动态变化；血清中浓度与瘤体大小、临床分期相关，可用来判断预后；测定方法精密度高、准确性高，操作简便，试剂盒价廉6。之前，临床上主要通过检测单一肿瘤标志物的手段，诊断原发肿瘤。然而，单一肿瘤标志物检测不但不易早期发现肿瘤，而且在良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断、肿瘤治疗效果的观察和评价以及肿瘤复发和预后的预测等方面都存在明显缺陷。因此在目前的临床实践工作中，人们往往联合检测多种肿瘤标志物，对肿瘤的预防和治疗提供了可靠的依据。可以说，依赖于肿瘤标志物灵敏、可靠、联合分析检测的早期诊断、早期治疗是征服肿瘤的关键7,8。因此，肿瘤标志物的灵敏检测方法成为近年肿瘤早期诊断领域的关键性课题。三、纳米材料与量子点纳米是一个微小的尺度单位, 1纳米是十亿分之一米(10-9m), 大约是单个原子直径的 4 倍。通过对在纳米尺度上新现象、新过程的观察, 纳米技术为人们提供了许多性能独特的工具、材料、器件和系统9。将纳米技术与癌症的早期检测结合起来，共同应用于肿瘤细胞、肿瘤组织的检测观察以及分析10-13等可以探测到癌症发生发展过程中的内部生物学特征，在分子水平对癌症进行早期检测与诊断。量子点(quantum dots，QDs)又可称为半导体纳米微晶体(semiconductornanocrystal)，是一种由II-VI族或III-V族元素组成的纳米颗粒，粒径约 1100 nm，量子点具有非常高的激发重叠区，能吸收大量的激发光。量子点的荧光量子效率很高，一般是有机染料1000倍，可以检出浓度极低的目标分子，而检测灵敏度明显提高。与传统染料相比，QDs 具有以下独特的光学特性14,15：（1）荧光发射波长可通过颗粒的化学组分和尺寸进行调控；（2）吸收光谱宽且连续，发射光谱窄而对称，通过单一波长光源激发不同尺寸量子点可产生多色荧光，从而实现一元激发、多元发射，应用于多通道同时检测；（3）光化学稳定性好，如 CdSe/ZnS 量子点的抗光漂白能力是普通荧光染料的 10-100 倍以上；（4）荧光量子产率较高（50-80%），具有较强的荧光信号，可极大提高分析灵敏度；（5）荧光寿命较长（20-50 ns），适用于时间分辨光学成像。因此，荧光量子点作为一种新型的无机荧光纳米材料，具有传统的荧光染料不可比拟的优势，其独特的荧光性质、优良的光谱特性和光化学稳定性受到越来越多的关注，广泛用于纳米尺度的化学生物传感与生物医学成像等领域。四、荧光量子点的制备与表面修饰（一） 有机金属合成法有机金属合成法是将有机金属前驱体烷基非金属或者烷基金属化合物溶液溶入到250400的配体溶液中，此时有机金属前驱体在高温下迅速溶解，新的成核晶核缓慢生长，逐渐长成为荧光量子点。20世纪九十年代，Murray等16研究者将金属前驱体Cd(CH3)2和TOPSe分别注入到剧烈搅拌的300TOPO配体溶剂中，通过调节反应温度，合成了表面包覆了TOP/TOPO 层的CdSe荧光量子点，其颗粒粒径为2.815nm。（二）水相合成法水相合成法17一般使用Se2 或Te2 作阴离子前驱体，Zn2 +、Cd2 + 或Hg + 作阳离子前驱体，多官能团巯基小分子如巯基乙酸(TGA) 、巯基乙醇、谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸、巯基乙胺等选作保护剂，溶液经过加热回流，前驱体混合溶液使得CdTe量子点不断成核并且不断生长长大。在不同的合成条件下，荧光量子产率可达20%5O%左右。（三）功能化修饰1.巯基化合物修饰巯基化合物修饰量子点主要是利用量子点表面的元素如镉、锌等与巯基之间较强的络合作用，基于巯基配体双功能分子来取代量子点表面的有机配体TOPO，使其从疏水性转变为亲水性，另一端的功能基团可与生物分子直接偶联。极性的羧基等赋予了量子点水溶性，同时游离羧基可通过偶联作用与蛋白质、多肽、核酸衍生物等生物分子的活性氨基反应形成较为稳定的荧光量子点。2.核/壳化修饰量子点通过另一种半导体对量子点的表面进行修饰，在其表面形成核壳型复合半导体结构，可以减少核量子点的表是通过包覆带隙能更大的半导体材料形成核/壳型量子点，达到修复和钝化单个量子点表面晶格缺陷的目的，所得的核/壳型量子点产物具有非常优异的荧光性质。3.聚合物修饰聚合物修饰量子点使用两亲的大分子，如含氨基、羧基的两段或三段型嵌段聚合物和磷脂类胶束等包覆量子点，其疏水端直接与TOPO结合，而亲水端暴露在外，使量子点具有水溶性，同时其所带的氨基、羧基可实现量子点的功能化18。另外还可将量子点包覆入带有功能基团氨基或羧基的水溶性高分子微壳或微球中，以实现量子点的水溶性化和生物功能化。4.静电子修饰静电作用修饰量子点是在量子点的表面修饰带负电荷的基团，通过正负电荷的作用力与带正电的分子结合。五、量子点在肿瘤检测中的应用（一）肿瘤成像优越的光谱性质使QDs作为荧光探针广泛用于纳米尺度的化学生物传感与生物医学成像等领域。多种半导体荧光量子点已被发展成为肿瘤标记物识别探针，实现了细胞以及活体层面肿瘤的成像检测。Lim等19合成了一种特殊的NIR QDs，首次实现了其用于生物体内血管的实时成像，有助于更好地理解QDs作为荧光造影剂进入生物组织用于生物成像时，组织的吸收、散射、厚度对其荧光性能的影响。Gao等20采用聚乙二醇( PEG) 包覆的QDs标记前列腺特异性膜抗原( PSMA)的抗体，发现 PEG化量子点由于被动靶向作用在肿瘤部位累积明显，实现了对表达前列腺癌的靶向成像，探测了QDs在动物体内的生物分布、非特异性摄取、细胞毒性等，取得了良好的检测灵敏度和多色能力。（二）生物传感器生物传感器就是包含酶、抗体、细菌、组织等识别剂的生物实体，QDs独特的光电特性，并且其具有较大的比表面积，能够提高生物标记检测灵敏度。基于高灵敏的QDs，已经成功构建出生物小分子和蛋白质的高灵敏传感器。最近的研究表明，基于荧光共振能量转移(FRET) 的生物传感器中，QDs可以用作荧光共振能量转移技术的给体。量子点探针可用于用于小分子物质，如三磷酸腺苷(ATP)、可卡因、蛋白质、血小板源性生长因子(PDGE)、凝血酶等2123的识别。（三）荧光免疫分析肿瘤的发生过程中，机体内会产生许多标志物，如PSA，EGFR，HER2。因此，对这些生物分子的分析方法就需要有敏感性好、成本低、能进行多组分同时检测等特点。QDs的激发波长范围宽，单一波长光源可以激发出不同大小的QDs，是实现多个组分同时检测的理想标记探针。尺寸可调的QDs可用于荧光免疫分析，使其在肿瘤临床诊断技术检测方面取得了进一步的发展。（四）量子点免疫层析量子点免疫层析技术是一种以免疫量子点技术、层析分析技术和免疫检测等相结合的一种技术。该技术的原理是：以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上流动，并同时使样品中的待测物与已固定于层析材料上的针对该待测物的受体(抗原或抗体)发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，运用紫外光激发下显示荧光。而游离的标记物则越过检测带，与结合的标记物自动分离。量子点免疫层析方法具有方便、快捷、价格低廉、灵敏度高等优点，可应用于抗原、抗体、药物、激素、重金属离子和疾病相关蛋白等诸多方面的检测。该方法今后的发展趋势主要有如下几个方面：(1)多种标志物的联合检测。有些肿瘤的标志物可能会有很多，为了降低检测的假阳性，提高检测结果的准确性，多种肿瘤标志物的联合检测具有很大的应用价值。(2)半定量或者定量检测。实现半定量或定量测定是将来免疫层析方法发展的重要方向24。根据 T、C 线上显色强度，应用简单仪器可以对各种检测物进行半定量或者定量检测。(3)提高检测的灵敏度。 有些肿瘤标志物的临界值很低，暂时还不能运用免疫层析技术来检测很低含量的待检测物，所以需要进一步提升检测的灵敏度，来满足实际样品检测的需要。六、总结荧光量子点在实际应用中仍存在一些问题，但随着荧光量子点的合成及修饰技术的不断完善，具有高稳定性、生物安全性的新型QDs会不断涌现，届时QDs必将成为最有前途的荧光标记物之一，在未来的检测肿瘤标志物领域得到广泛应用。参考文献1Boshart, L.; Vlot, EA.; Vermeij-Keers, C. European Journal Of Plastic Surgery, 2000, 4, 217-223.2McCarthy, F; Brown, A. J. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 373, 109-112.3Wilson, S. R.; Strand, M. F.; Krapp, A.; Rise, F.; Herstad, G.; Malterud, K.E.;Krauss, S. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, 53,497-502.4Magliano, M. P.; Hebrok, M. Nature Reviews| Cancer, 2003, 3, 903-911.5Kwok P Y. Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms. Annual review of genomics and human genetics, 2001, 2(1): 235-258.6陈鸿琪. 蛋白质定量分析的进展. 理化检验: 化学分册, 2000, 36(7): 333-336.7Nsslein-Volhard, C.; Wieschaus, E. Nature, 1980, 287,795-801.8Ingham, P. W.; McMahon, A. P. Genes Dev., 2001, 15, 3059-3087.9Taback, B.; Chan, A. D.; Kuo, C. T.; Bostick, P. J.; Wang, H. J.; Giuliano, A. E.; Hoon, D. S. B., Detection of Occult Metastatic Breast Cancer Cells in Blood by a Multimolecular Marker Assay. Cancer research 2001, 61, (24), 8845-8850.10Jaiswal, J. K.,Mattoussi,H” Mauro, J. M” et al. Long-term multiple color imagingof live cells using quantum dot bioconjugates. Nat. Biotechnol?,2003,21 (1);47-5111Wu, X. Y., Liu,H. J., Liu, J. Q., et al. Immunofluorescent labeling of cancermarker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat.Biotechnol., 2003,21 (4): 452-452.12Alivisatos, P. The use of nanocrystals in biological detection. Nat. Biotechnol.,2004,22 (1): 47-52.13Brachez,M., Moroime, M., Gin,P., et al. Semiconductor nanocrystals asfluorescent biological labels. Science, 1998,281 (5385): 2013-2016.14J K Jaiswal, S M Simion. Trends Cell Biol, 2004,14( 9) : 497 504.15A M Smith, X H Gao, S M Nie. Photochem Photobiol, 2004，80( 3) : 377 385.16Murray C B, Norris D J, Bawendi M G. Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE (E=sulfur, selenium, tellurium ) semiconductor nan0crystallites J, J Am Chem Soc，1993，115( 19)