【精品PPT】细菌内毒素检查法.ppt

细菌内毒素检查法 中国药典 2010年版培训班 山东省药品检验所2010 10 主要内容 细菌内毒素检查相关理论及概念 中国药典 2010年版增修订情况细菌内毒素检查法及注意事项 细菌内毒素检查相关理论及概念 细菌内毒素鲎试剂鲎试剂与内毒素的反应机理细菌内毒素检查 名词解释 细菌内毒素检查法 bacterialendotoxinstest 热原检查法 pyrogentest lal limulusamebocytelysate testtal tachypleusamebocytelysate testlimulustest 细菌内毒素的发现 细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来 它是在研究发热物质过程所引成的 1933年boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来 进行化学免疫学方面的研究 到1940年时候 morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体 到了1950年以后 随着生物学 物理化学 免疫学以及遗传学等的进步发展 细菌内毒素的研究工作 尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来 boivin morgan 内毒素是由多糖 脂质和蛋白质组成的复合体 脂多糖又由化学和生物性质不同的特异o抗原 核心多糖和类脂a 脂质a 组成 内毒素的多糖结构 细菌内毒素参考品的建立 不同细菌的内毒素对于鲎试剂的反应活性不同 为保证鲎实验法的平行性和重复性 要建立一种内毒素的标准物质作为实验中的控制标准 由于大肠杆菌内毒素在天然内毒素中的致热活性比较高 在各种细菌内毒素对鲎试剂反应的灵敏性上处于中值的位置 且其稳定 可溶 因此一般都采用大肠杆菌的内毒素作为标准内毒素参考品 标准内毒素与环境内毒素标准内毒素 指经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素 作为细菌内毒素检查的参考品 国际标准品 is 参考标准品 rse 国家标准品 ns rse 标准内毒素工作标准品 cse 80年代以前以重量作为内毒素的单位1982年usp20引入以生物效价为量值的内毒素单位 eu endotoxinunit 细菌内毒素的量值 cp2010年版规定内毒素标准品溶解后要在旋涡混合器上混合15分钟 以后的每一步稀释前要至少混合30秒 其他国家药典也有类似要求 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素效价偏低 造成灵敏度标示偏高 阳性对照不凝等不正确的实验结果 细菌内毒素标准品的稀释 鲎是一种海洋无脊椎动物 蓝色的血液 种类以及分布 美洲鲎 北美洲东岸海域中国鲎 中国东南沿海南方鲎 泰国和马来群岛海域圆尾鲎 东南亚西部海域 世界上现存鲎的种类 鲎试验的发现 1956年johnshophins大学动物学家frederik bang发现革兰阴性细菌的粗制品能使鲎的血细胞凝聚 1963 1964年jack levin和bang对细菌引起鲎血凝聚进行研究 用内毒素和鲎血细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是一种酶反应 多位学者对鲎血细胞溶解物 lal 进行研究 阐释了凝聚机制 鲎试剂 鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成鲎试剂的种类 依据鲎的种类分 美洲鲎试剂 lal 中国鲎试剂 tal 圆尾鲎试剂 cal 依据检查方法分 凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂依据内毒素和鲎试剂反应的专一程度分 普通鲎试剂和特异性鲎试剂 鲎试剂与分类 凝胶法鲎试剂与内毒素的反应机理 复杂的酶促反应过程 bet的目的和前提 确保药品不含有能导致患者发热反应发生的足量的细菌内毒素 一定量的细菌内毒素可以被人体耐受 也是sfda允许的 前提是假定引起发热反应的热原几乎全部是内毒素 二 2010年版 中国药典 细菌内毒素检查法增修订情况 2010版与2005版区别修订背景注射用药品 生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则 2010版与2005版区别 修订背景 1 细菌内毒素与检查用水除了强调内毒素含量外 还强调应对内毒素试验无干扰作用 2 强调用干热灭菌法 250 30分钟以上 去除内毒素与热原法同步 3 根据某些药 如抗肿瘤药 用体表面积计算给药量的需要 增加了按体表面积给药时的计算方法 注射用药品 生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则 本原则依据2010年版药典制订 适用于注射用药品 生物制品建立细菌内毒素检查项目时进行的实验及研究 需建立内毒素检查项目的品种 质量标准中有家兔热原检查法需转换为细菌内毒素检查方法的品种 用于注射给药 但未有热原质量控制的品种 注射用新药需建立热原质量控制的品种 用于静脉给药的原辅料 建立方法时对鲎试剂及样品的要求 同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂每个品种至少三批样品 上市品种应检测两个以上生产厂家 新药需检测连续生产的样品 确定内毒素限值 一般按公式l k m计算 m为人每公斤每小时临床最大用药剂量 依据药品使用说明书 临床用药须知 确定 儿童用药如大于成人 以儿童为准 为保障安全用药 对于抗感染 抗肿瘤 治疗心血管疾病等重症用的药品 需联合用药的药品 可根据计算值适当调整 严格至计算限值的1 2或1 3 对于体积在100ml以上 包括100ml 的复方静脉输液类品种 内毒素限值一般按0 5eu ml计 其他单方静脉输液品种除另有规定外也可按用药剂量计算 以eu mg或eu u表示 对于美国 欧洲或日本药典已收载的 并已建立细菌内毒素检查法的品种可参考国外药典规定的限值 与按公式计算出的数值比较 以严格者为该品种的限值 如果使用的是国外药典的限值 应以最新版本药典为准 干扰实验 建议使用较低灵敏度鲎试剂 0 5eu ml或0 25eu ml 以避免供试品中内毒素的阳性影响 三 细菌内毒素检查法 细菌内毒素检查法 定义 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法 细菌内毒素的量用内毒素单位 eu 表示 1 概述 凝胶法光度测定法浊度法 终点浊度法和动态浊度法 显色基质法 终点显色法和动态显色法 凝胶法 最简单 经济 应用最广泛 中国药典的 仲裁 方法对干扰相对不敏感 有两倍的误差较光度测定法不灵敏 光度测定法 灵敏 动态浊度检测限0 001eu ml 动态显色0 005eu ml 检测范围宽 动态浊度达到100eu ml 动态显色50eu ml 较之凝胶法易受干扰对结果的解释更慎重 实验基本流程图 供试品 限值确定 最大有效稀释倍数确定 供试品干扰实验 正式实验 结果判断 2 试剂 仪器设备等 细菌内毒素检查法所应用的试剂 主要包括 鲎试剂 细菌内毒素检查用水 细菌内毒素工作标准品等 国内鲎试剂的生产情况 安度斯生物技术有限公司湛江海洋生物制品厂福州新北鲎试剂厂厦门鲎试剂厂福州东方鲎试剂厂福州平潭东方鲎试剂厂广西北海鲎试剂厂 细菌内毒素检查用水1 药典规定 凝胶法 0 015eu ml光度法 0 005eu ml且对内毒素试验无干扰作用2 和鲎试剂配套使用 细菌内毒素国家标准品 rse 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成 用于标定 复核 仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价 细菌内毒素工作标准品 cse 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价 用于试验中鲎试剂灵敏度复核 干扰试验及各种阳性对照 仪器设备与实验器具 分析天平超净工作台细菌内毒素检查专用干式恒温器电热恒温干燥箱旋涡混合器 实验器具 试管架 镊子 消毒棉球 称量瓶 30mm 60mm 刻度吸管 1 2 5 10 15ml 各种试管 中号金属饭盒 加样器等 目前已有多种无热原的一次性用品 实验器具的洗涤与除内毒素 实验中所使用的玻璃仪器清洁与否 直接影响试验结果 实验中使用的所有玻璃器具一般经洗液浸泡后 取出用自来水 纯化水依次冲洗干净 可用纯化水浸泡 实验器具的洗涤与灭菌 试验中所用的器皿 需要经过处理 除去可能存在的外源性内毒素 常用的方法是250 干烤至少30分钟 达到规定时间后 关断电源 待烤箱温度自然降至室温 一般约需6 8小时 将冲洗干净的试管 称量瓶 玻璃小瓶置金属饭盒内 吸管置金属筒内 放入烤箱 于250 干烤至少30分钟 放冷 密闭保存备用 灭菌后的实验器具应在规定时间内使用 实验器具的洗涤与灭菌 也可用其他适宜的方法 并应确证不干扰细菌内毒素的检查 除去外源性内毒素的玻璃器皿应在规定内使用 否则须再次除去可能存在的外源性内毒素 试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染 3 供试品溶液的配制 按各药品项下规定 取供试品 精密称定于称量瓶 事先已除去外源性内毒素 中 按其效价或含量 用各药品项下规定的稀释剂稀释至规定浓度 充分摇匀使完全溶解 放置5 10分钟 再摇匀 放置备用 3 供试品溶液的配制 一般要求供试品溶液的ph值在6 0 8 0的范围内 对于过酸 过碱或本身有缓冲能力的供试品 需调节被测溶液的ph值 可以使用酸 碱溶液或适宜的缓冲液调节ph值 酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已经去除内毒素的容器中配制 缓冲液必须经过验证不含内毒素或干扰因子 3 供试品溶液的配制 注意事项 1 供试品溶液的浓度如以 mg ml表示 此 mg ml是指供试品溶液中活性物质的浓度 2 样品初试时一般按照样品的估计百分含量或效价单位计算稀释液溶剂加入量 复试时 则必须根据该供试品的实际百分含量或效价来计算 3 考虑供试品本身的体积 4 内毒素限值的确定 内毒素限值l k m每小时静注入人体内 不引起热原反应的最大内毒素剂量 阈值 k 5eu kg h l为供试品的细菌内毒素限值 以eu ml eu mg或eu u 活性单位 表示 k为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量 以eu kg h 表示 注射剂k 5eu kg h 放射性药品注射剂k 2 5eu kg h 鞘内用注射剂k 0 2eu kg h m为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量 以ml kg h mg kg h 或u kg h 表示 人均体重按60kg计算 人体表面积按1 62m2计算 注射时间若不足1小时 按1小时计算 按人用剂量计算限值时 如遇特殊情况 可根据生产和临床用药实际情况做必要调整 但需说明理由 内毒素限值 大输液k 0 5eu ml注射用水k 0 25eu ml注意m一定要找到最大量 如果有儿童用量 按体重计一般高于成人量 内毒素限值 大部分药品的内毒素限值 k 最大给药剂量 mg kg 假如剂量为14 3mg kg 内毒素限值 5 14 3 0 35eu mg假如此产品的浓度为100mg ml内毒素限值 0 35 100 35eu ml 5 凝胶法鲎试剂灵敏度复核试验 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时 应进行鲎试剂灵敏度复核试验 5 鲎试剂灵敏度复核试验 鲎试剂的标示灵敏度 在本检查法规定的条件下 使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度 其单位用eu ml表示 5 鲎试剂灵敏度复核试验 1 取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支 用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕 用75 酒精棉球擦拭后启开 防止玻璃屑落入瓶内 5 鲎试剂灵敏度复核试验 2 将细菌内毒素国家标准品或工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解 在旋涡混合器上混匀15分钟 然后根据鲎试剂标示灵敏度 制成2 0 5 和0 25 4个浓度的内毒素标准溶液 每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟 5 鲎试剂灵敏度复核试验 3 取鲎试剂 用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕 用75 酒精棉球擦拭后启开 防止玻璃屑落入瓶内 将鲎试剂按标示装量复溶 轻轻转动瓶壁 使内容物充分溶解 避免产生气泡 取0 1ml 支的鲎试剂18支备用 规格大于0 1ml 支的鲎试剂按其标示量加入细菌内毒素检查用水复溶后分装 5 鲎试剂灵敏度复核试验 4 按检查法项下试验 将待复核的鲎试剂18管放在试管架上 排成5列 4列4管 1列2管 其中前4列分别加入4个不同浓度的内毒素标准溶液0 1ml 每1个内毒素浓度平行做4管 另一列2管加入细菌内毒素检查用水0 1ml 加样结束后 用封口膜封口 轻轻混匀 避免产生气泡 垂直放入细菌内毒素检查专用干式恒温仪中 在37 1 保温60分钟 2分钟后 观察并记录结果 5 鲎试剂灵敏度复核试验 5 试验结果中 如最大浓度2 管均为阳性 最低浓度0 25 管均为阴性 阴性对照均为阴性 按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值 c c antilg x 4 式中x为反应终点浓度的对数值 lg 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度 5 鲎试剂灵敏度复核试验 6 当 c在0 5 2 包括0 5 和2 时 方可用于细菌内毒素检查 并以标示灵敏度 为该批鲎试剂的灵敏度 结果判断 上图 阳性 下图 阴性 6 供试品的干扰试验 当进行新药的内毒素检查试验前 或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时 须进行干扰试验 当鲎试剂 供试品的配方 生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时 须进行干扰试验 干扰试验实际上是两个鲎试剂灵敏度复核试验 一个真正的鲎试剂灵敏度复核一个 鲎试剂灵敏度复核 试验是用一定浓度的供试品溶液替代bet水 鲎试剂复溶仍采用bet水 也就是说 用供试品溶液将同一支细菌内素素标准品制成2 0 5 和0 25 4个浓度的内毒素标准溶液 进行干扰试验一般步骤 供试品限值确定根据鲎试剂的灵敏度范围确定mvd范围 供试品溶液浓度范围 预试验 初筛试验 确定样品最大不干扰浓度正式干扰试验 预试验 通过一系列含有标准内毒素浓度为2 的供试品溶液与后试剂反应 初步筛选出不干扰的浓度范围 前提 供试品对内毒素检查的干扰多数为抑制目的 避免干扰试验的盲目性 6 供试品的干扰试验 1 按鲎试剂灵敏度复核试验项下 用细菌内毒素检查用水和未检出内毒素的供试品溶液且不超过最大有效稀释倍数 mvd 的溶液 分别制成含细菌内毒素工作标准品2 0 5 和0 25 4个浓度的内毒素标准溶液系列c和b 凝胶法干扰试验溶液的制备 注 稀释倍数是指内毒素浓度 而其中供试品浓度是不变的 6 供试品的干扰试验 2 鲎试剂的准备 36支3 按检查法项下试验 照表一制备溶液a b c和d 将准备好的18管鲎试剂放在试管架上 排成5列 1列2管作为a 4列4管作为b 其中4列分别加入4个不同浓度的含供试品的内毒素标准溶液 另一列加入供试品溶液 6 供试品的干扰试验 将准备好的另外18管鲎试剂放在试管架上 排成5列 4列4管作为c 1列2管作为d 其中4列分别加入4个不同浓度的内毒素标准溶液 另一列加入细菌内毒素检查用水 加样结束后 用封口膜封口 轻轻混匀 避免产生气泡 垂直放入细菌内毒素检查专用干式恒温仪中 在37 1 保温60分钟 2分钟后 观察并记录结果 6 供试品的干扰试验 4 试验结果中 只有当溶液a和阴性对照溶液d的所有平行管都为阴性 并且系列溶液c的结果在鲎试剂灵敏度符合范围内时 试验方为有效 按下式计算系列溶液c和b的反应终点浓度的几何平均值 es和et 6 供试品的干扰试验 es antilg xs 4 et antilg xt 4 式中xs xt分别为系列溶液c和b的反应终点浓度的对数值 lg 6 供试品的干扰试验 当es在0 5 2 包括0 5 和2 及et在0 5es 2es 包括0 5es和2es 时 认为供试品在该浓度下无干扰作用 若供试品溶液在小于mvd的稀释倍数下对试验有干扰 应将供试品溶液进行不超过mvd的进一步稀释 再重复干扰试验 6 供试品的干扰试验 供试品的最大有效稀释倍数 mvd 按下式计算 mvd cl 式中 l 为供试品的细菌内毒素限值 c 为供试品溶液的浓度 抗生素样品浓度以活性成分计 当l以eu ml表示时 c为1 0ml ml 当l以eu mg eu u表示时 c为mg ml u ml 如供试品为注射用无菌粉末或原料药 则mvd取1 可计算供试品的最小有效稀释浓度c l 鲎试剂的标示灵敏度 eu ml 7 凝胶限度试验 a为供试品溶液 b为供试品阳性对照 c为阳性对照 d为阴性对照 7 凝胶限度试验 1 供试品溶液的配制用细菌内毒素检查用水将供试品配成对应mvd的浓度 2阳性对照液的制备 用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品制成2 浓度的内毒素溶液 7 凝胶限度试验 3供试品阳性对照液的制备 用被测供试品溶液将细菌内毒素工作标准品制成2 浓度的内毒素溶液 实际工作中一般采用2倍mvd的供试品溶液和4 的内毒素溶液等体积混合的方法配制 因此供试品稀释过程要有2mvd和mvd两个浓度 内毒素标准品稀释要有4 和2 两个浓度 7 凝胶限度试验 4将8管鲎试剂放置在试管架上 其中2支加入0 1ml按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品管 2支加入0 1ml阳性对照液作为阳性对照管 2支加入0 1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照 2支加入0 1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管 7 凝胶限度试验 5加样结束后 用封口膜封口 轻轻混匀 避免产生气泡 垂直放入细菌内毒素检查专用干式恒温仪中 在37 1 保温60分钟 2分钟后 观察并记录结果 注意在保温和拿取试管过程应避免受到震动制成假阴性结果 7 凝胶限度试验 6结果判断将试管从恒温仪中轻轻取出 缓缓倒转180 时 若管内形成凝胶 并且凝胶不变形 不从管壁滑脱者为阳性 记录为 未形成凝胶或形成的凝胶不坚实 变形并从管壁滑脱者为阴性 记录为 若阴性对照溶液的平行管均为阴性 供试品阳性对照溶液的平行管均为阳性 阳性对照溶液的平行管均为阳性 试验有效 7 凝胶限度试验 结果判断供试品2管均为 应认为符合规定 如2管均为 应认为不符合规定 如2管中1管为 1管为 按上述方法另取4支供试品管复试 若所有平行管均为 即认为符合规定 否则判供试品为不符合规定 凝胶法限量检查 美国药典和欧洲药典溶液a和供试品阳性对照液b使用不超过mvd的供试品溶液 usp32 preparesolutionaandpositiveproductcontrolsolutionbusingadilutionnotgreaterthanthemvd ep6 0 preparesolutionaandsolutionb positiveproductcontrol usingadilutionnotgreaterthanthemvd 8 凝胶半定量试验 凝胶半定量试验系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量 按下表制备溶液a b c d 按照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作 8 凝胶半定量试验 8 凝胶半定量试验 注 a为不超过mvd并且通过干扰试验的供试品溶液 从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍 2倍 4倍和8倍 最后的稀释不得超过mvd b为2 浓度标准内毒素的溶液a 供试品阳性对照 c为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 d为阴性对照 8 凝胶半定量试验 结果判断1 若阴性对照溶液d的平行管均为阴性 供试品阳性对照溶液b的平行管均为阳性 系列溶液c的反应终点浓度的几何平均值在0 5 2 之间 试验有效 8 凝胶半定量试验 系列溶液a中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以 为每个系列的反应终点浓度 所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度 按公式ce antilg x 2 如果检测时采用的是供试品的稀释液 则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数 8 凝胶半定量试验 如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性 应记为内毒素浓度小于 如果检验的是稀释过的供试品 则记为小于 乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数 如果供试品溶液的所有平行管均为阳性 应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以 8 凝胶半定量试验 若内毒素浓度小于规定的限值 判供试品符合规定 若内毒素浓度大于或等于规定的限值 判供试品不符合规定 细菌内毒素定量检查法 发展现状 我国2000版药典细菌内毒素检查法应用指导原则正式列入 定量法在我国得到肯定 应用和推广 2005版将2000年版的指导原则合并入检查法中 正式收载细菌内毒素定量检测法 光度测定法 分类 终点浊度法浊度法光度测定法动态浊度法 定量法 终点显色法显色基质法动态显色法 浊度法 原理 利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法 根据内毒素与鲎试剂的反应机理 被激活的凝固酶切断凝固蛋白原中特定位置的精氨酸肽链 形成凝固蛋白 产生浊度变化 用适当浊度仪进行定量分析的一种方法 根据检测原理 可分为终点浊度法和动态浊度法 终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度 吸光度或透光率 之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法 动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间 或是检测浊度增加速度的方法 显色基质法 原理 利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法 根据被内毒素激活的凝固酶水解鲎三肽中精氨酸肽链 释放出对硝基苯胺 pna 用冰醋酸终止反应进行吸光度测定 或用游离的pna和偶氮试剂反应 最终形成偶氮蓝复合物显色而进行比色测定的一种方法 根据检测原理 分为终点显色法和动态显色法 终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法 动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间 或是检测色度增长速度的方法 内毒素与鲎试剂的凝胶反应 光密度od 时间 分钟 不同浓度的内毒素反应曲线 鲎试剂定量检测内毒素原理 检测样品原理 动态浊度法实验方法 1 标准曲线的可靠性实验 r绝对值 0 9802 供试品的干扰实验 mvd l c 1测定及判断 回收率50 200 3 供试品的定量测定 测定结果与l比较 实验器材 微量移液器 配套的除热原玻璃吸头