蛋白检测篇8-酵母双杂交系统.docx

编号：1-8主题：酵母双杂交系统概述：酵母双杂交由Fields在1989年提出，他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域，分别是位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain，AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence， UAS)，并与之结合。而AD则是通过与转录机构（transcription machinery）中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点： 作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。酵母双杂交系统仍存在一些局限性：双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。酵母双杂交系统的一个重要的问题是假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生假阳性结果。目的：1.发现新的蛋白质和蛋白质相互作用；2.在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用；3.筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响；4.建立基因组蛋白连锁图，原理：酵母的转录激活因子GAL4由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域DNA结合域(DNA binding domain ,BD)和的转录激活域(transcription activation domain,AD)。BD可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而AD则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的BD或AD不能激活基因转录，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。酵母双杂交系统主要利用酵母的GAL4的这个特性通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因敏感地检测到。步骤：1、酵母菌株的保存与表达型验证1)用接种环将冻存在-70 C的酵母Y190贮备备液划于YPD琼脂培养平板上，在30 C培养，直到菌落直径达到2mm，约需3-5天，密封平板，4C保存。2)正常的Y190菌落由于ade2-101突变而呈粉红色，并且直径2mm。挑取3-4个菌落置于不同培养平板上(SD/-Trp，SD/-Leu,，SD/-His，SD/-Ura，YPD)，培养 4-6天。核对其不同的生长情况。由于Y190可以有轻微的His3泄漏表达，所以需要在SD/-His的培养基中加入的竞争性拮抗剂3-AT(3-ammino-l,2,4-triazole，25mmol/L)，以抑制背景生长。2、制备酵母感受态细胞挑取数个直径2-3 mm的酵母单菌落放入1 ml YPD液体培养基中，剧烈振荡使菌落分散，然后转入50ml YPDA液体培养基中。以250 rpm、30C的条件培养16-18h达到稳定期。将过夜培养物转入YPDA液体培养基中，继续培养4 h，使OD600值达到0.4-0.6。室温下4,000 rpm离心5 min收集菌体，用无菌IxTE洗菌体后，用新鲜配制的1 xTE/LiAc溶液重悬。3、酵母感受态细胞的转化1)制备PEG/LiAc溶液。2)将各组分在反应管中混勾(BD载体构建产物0.1 g + AD载体构建产物0.1 g +鲑精 DNA 0.1 mg)。3)在反应管中加入酵母感受态细胞100 l，混匀；4)加入PEG/LiAc溶液0.6 ml，混匀；5)30 C培养30min；6)加入DMSO 70 l以达到10%的终浓度，轻轻颠倒混匀；7)42C水浴中热休克15 min；8)冰浴10 min；9)14,000 rpm离心5 s沉淀细胞；10)用IxTE重悬细胞。4、共转化产物的培养和处理共转化的酵母细胞铺于SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)培养平板上。30C倒置培养7-10天，直至菌落出现。选择直径2 mm的淡粉色菌落,用牙签重新点种在新鲜的SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)培养平板上，继续培养2-4天，此时可进行半乳糖苷酶活性检测。5、LacZ基因活性的测定1)将SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)培养平板上的克隆印迹到新华3号滤纸上；2)滤纸克隆面朝上，在液氮中冷冻10s以上，取出，室温放置数分