关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结.doc

关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结ChIP实验原理在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。可以利用ChIP研究转录因子（ transcription factor, TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞收集细胞，超声破碎加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物解交联，纯化富集的DNA-片断PCR分析。ChIP实验步骤第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37甲醛，使得甲醛的终浓度为1。（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2106个细胞。这样每100ul溶液含1106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5106个细胞。本次细胞长得约为80。即为4106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。7、超声破碎：VCX750，25功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。（二）、除杂及抗体哺育。8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于80度。300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50PIC。再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。（三）、检验超声破碎的效果。取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。第二天：（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转2h。13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。洗涤溶液：a. low salt wash buffer-one washb. high salt wash buffer-one washc. LiCl wash buffer-one washd. TE buffer-two wash15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10SDS， 100ul 1M NaHCO3， 800ul ddH2O，共1ml。每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65度解交联过夜。第三天：（一）、DNA样品的回收17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。18、每管加入10ul 0.5M EDTA， 20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。45度处理2h。19、DNA片段的回收omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。（二）、PCR分析ChIP技术总结（一）、关于细胞细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般细胞长到7580比较好。（二）、关于抗体！抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。（三）、关于交联与超声破碎！这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp1000bp。但是200bp2000bp的范围也是可以接受的。（四）、关于操作希望尽可能的保持低温（4度）。沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。（五）、关于解交联虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联