趋化因子受体CXCR4的结构与功能.doc

趋化因子受体CXCR4的结构与功能第23卷第2期瑚1年2月第三军医大学ACrAACADEMlAMDlClEMR,ITARISTERTIAEV.23.N0.2Feb2l185章编:10C54042001)c皿.01854)5趋化因子受体CXCR4的结构与功能麓誊j郑红,StephenCPeipe,朱锡华(第军医大学基础学部全军免疫学研究所,重庆400038;JamesGrahamBrownCan-cCenter,uv盯竹orImlvilk,KY,4O2O2,USA)提要目的认识趋化因子受体CXCFI4之结构功能的关系方法分别建立野生型趋化因子受体CXCR4及CXCR2,5个CXCR4/CXCR2嵌台受体和2个CXCR4突变受体的CHO稳定表达细胞株.以配体一受体结合试验,细胞微生理监测术,体外细胞一细胞融合宴验为手段观察各变异受体与重组SDH13的结台能力,在受刺激后的信号转导能力,以及作为HIvI辅助受体的能力:结果有4个变异受体(2444a,4442,4222,CXCR4-Tr)保持r程度同的与SDF-l口的结合能力,其中2个(2-4a,CXCR4-Tr)保留了程度不同的信号转导能力;除1个变异受体(42垃)外,其它变异受体都程度不同的具有辅助受体功能.结论CXCR4以多个结构区域参与与SDF一1口的相互作用.其端胞外区足以具有SDF一口的高亲和性结合能力.第三环链对CXCR4的结合能力也有其特定的贡献.CXCR4的信号传导不仅需要保守结构DRY盒,而且还需要贯穿整个分子的7个跨膜区域在受配体刺激后形成并维持一定的构象.CCR4的辅助受体功能结构域与配体结合功能结构域问存在交l殳重卺=美键词:CXCR4;SDF-IS;嵌合体;结掏功能中图法分类号:R341.43;R392.I1文献标识码:AStructure-functioncorrelationofchemokinereceprCXCR4ZttENGHong,StephenCPeiper,ZHUXih.a(I)ntofl一0lf,ThirdMiLiMedicalUniverstv,c】1g400038,China)Alhstl-act:OtYttiveexplomthetonelati帅betweenstrm:turedomainsaudfum:tionofc咖l(inereceptorCXCI4MeltloOsAftertheh【吐of_dtypechemokinereeeprCXCR4andCXCR2,5CXCR4/CXCR2chimeras,2CXC114IlulttstablyexpressedgiltCHOcelllire,allvarianlsb0tmdaefivilyththellgantrecombinanthumanSDF-lsltrmtsductJonahilitvafterimulatiOlqandtheirfmctionascrecep-lotrH一1werestudied钠lh1ir-dbindinga啪y.cytosensdmierophysimnetryandcellcellreceptorgenefusionassayP.t1sATrngall7clcxcH4receptors,3ehlme,;(2444a,4442,4222)aldlmutant(CXCR4-tr)咖dbe.h0uIldwilhsD1p_nY坞degrees,0fch)2444atotallyaadcxclpartLallymaintainedsignalingM1dlanreceptors4222couldaetaseoreeeptorsflvl(LA1)inv,yingde.eesGc:tusionSeveralslntchlaedomainsofcXCH4areinvoIvedinthebindingwithsDlBAmongthesedomains.NterminalexU-acellulardmnamhighaffinitybetmdCalxabilitywithSOrq13,andthe3rdextracellularloopcontributestothebindingioo.Al小theCterminalintrac,ellulardomainhasnoas.ciafionwiththemntetmrme0ftheoverall趾nJctLlreofthereceptorandthellgandboundcapability,therisdecrnthisd0IIlainistmrrcatedForCXCR4signg,n01onlytheeorrmdmotifDRYbexisned,butalsothecharterized0岫一fionofthewI】olemdeculefI_kformedwhenaetivationisreqmredTherearesolfltlm.edapsbeteemsD】Bboanddonminsandcoreeeptorfun.tiondomaininLllar.-ture0fCXcR4Keyw0rdb:CXCR4:SDF-1日;ehimeras;straeturftmctJon最近5年中,发现趋化因子及其受体在HIV(HlJ.illlailtmmnnodeficieneyvires)感染中起关键作用,成为研究的热点之一.趋化因子行使其功能由趋化因子受体介导.它们不仅在宿主对病原因子的清除,炎症反应及过敏性疾病,免疫细胞的发育,分化及免疫系统的自身稳定等方面都起重要的作用,而且在心脏及血细胞的发育,血管的发育,中枢神经系统神经网络的发育,损伤的修复和肿瘤的生长和恶化中起作用.这些研究进展将趋化因子及其受体的重要性从简单的免疫调节因子大大的扩展到过去未曾料到的多种生物学功能之中.CXCR4是T细胞一嗜眭H.1的主要辅助受体,其配体SDF-lo=/能够抑制该类HIV-I的感染性.SDF-1作者茼介:郭红(1961一),鼻.四川省都江堰市,博上.副研究员,主要从事拍化园子生物学方面的研究.筮表论文l5篇现在第:军医大学附暄西南医皖缘台耍验研究中心j怍.电话:0为1鹋7544玎收葛日期:2i3-10-15?謦目日期:_0I基困缺失的小鼠或CXCR4基因敲除的小鼠,其B细胞,骨髓细胞发育缺损,小脑神经原迁移紊乱,最终导致死亡.可见SDF-1tCXCR4具有重要的生理意义.我们在获得纯化的重组SDF-I的基础上,建立了稳定表达cxcR4,0(cR2系列嵌合受体,突变受体的CHO细胞系.以配体结合试验(IJgandbjnda,ay),细胞敏感仪,细胞微生理监测术(Cytosertsor/Microphysiometry),细胞.细胞报道基因融合实验(Cellcellreporterel1;fusionassay)为手段,研究CXCR4参与SDFqO结合及其信号传导的结构域的信息,以探讨其配体结合功能及辅助受体功能与结构域间的关系.为研究以能阻断受体功能的受体拈抗剂为途径的防治策略提供数据.1材料与方法1.1实验材料纯化的重组SDF-lp,自制-SDrqt3,美国DLlPct-l86第三军医大学第23卷NEN公司产品.CXCI4/CXCR2嵌台受体嫂突变体范隆质粒,由Dr.Peiper实验率掏建构建的8个胜台体丑突变体的结构示意和命名见罔1彳牛受体基冈均插于xDNA3I卜一cxCR4/CXCR2嵌台受体及点突变体表达质粒:pBBS242,Dr.Peiper陴f一实验窜提供:pSP72,荧目Niwogeng公司产品表达细胞:巾国仓鼠卵巢细胞系(CHO),Hela细胞系,鹌鹑纤维瘤细胞系(qr6),由DrPeiper实验窜提供.细胞一细胞融台实验所需表达质粒:pcDNA3.ICIM.pcDNA3.I-lae/17(PcMV缺陷),vcB-4】(表达重组的lr_嗜性HIV包膜糖蛋白lAT).vTF1.I(表达ll7RNA多聚酶),vCI6(表达七融合能的包膜糖蛋白),由Drir实验窜提供:Ez,RI,tfiMIII.L,Promega产品引物台成,B10SYNTHESISIncarporeted公百I产品.T4DN4连接酶,感受态细菌DH5,MEM一.培养液,转染培养液(0p【-MEbIIReducedSemmMedium),脂质体转染试剂(1Jpofet.tamineagent),2.5%胰酶一DMEM艘总RNA抽捉试剂(TR/ZOL(Reagent),RT-PCR试剂,美困GIBCO-BRL公司产品.细菌质粒提取试剂盘(QLAprepMinipmp)收胶内DNA片段试剂盒【QIAqlllckSpin),美QIAGEN产品测序试剂盒(TheretoSequer,eradiolabeledterminatorcclessiuencingKit),?myers帅1JEScIENCE产品.潮霉索B(Hyg=ml>ciuB),l*ehdngerMm.eim公司产品鼠抗人CXCR2单抗(别N端),兔抗人CXCIM多抗(识别N端),鼠抗人CXCR4单抗(识别1,2.3外环链),美国BIO-RAD公司产品羊抗鼠lgG-PE(I)fnn【H_hTm),美国Biosoume产品PcR仪,Gene&rpPCRS,estem96OO,美国P公司产品.计数器(CPBILat1IAuto一(mnma),美国PACKP,D公产品.微生理仪(CytosensorMicmphyuiomelex),美国MolecularDevices公司产品流式细胞仪(0wCvtometer),Epic一Ehte,美国Beckman公一J产品.?砌CXCl4CXCR22442a2442b图1各变异受体结构示意图Fig1alangul00Cl附d印;cI9由即啦dc枷yumfmm】efttond1IrepllNtemdnusdteIextr一】tdarIx,.1】2ndexlracelluarlrg*0andthe3n】excellularI(H一;2:|k口rFnbHtur4dmtICXCI>d;4:RE1sHr【thatfmmCXCR4;【:XC|Tr1sthe【n岫Id】r叫tIIoftheCleirfus;CXCRa.一4aAjLIhAAmplaJremulast】)RYboxl2方击121CXCR4点突变体及CXCR4/CXCR2嵌合受体Clio稳定表达细胞系的建立1.2】.1突变体及嵌合受体的亚克隆亚克隆:用凸I+nI从pcDNA3I上切下嵌台体DNA片段,切开9.5P72质粒并分别回收之用T4DNA连接酶分别将切开的pSP72与各嵌台体DNA片段连接起来一将含嵌台体DNA的质粒用EcoRI+,II1切FpSP22中台体片段,切开载体pBBS242片段和载体回收后竖连接,转化,摇菌,纯化得到新质粒上胶电泳验证一测序:测序模版为各含嵌合体片段的pBR;242质粘所用引物为m.up-s:5CACGTCCC(-;ATCC-C3:IJlSI:5GTCAGTGAG(RIAGATGAC3:LR-DRY-S:5GITGATGCCGTGGCA4AC3:ILgRB一删:5TCCFGAACCTAGCCrr3;ILSRBs2:5研mAcrrrrCcG%3测序包括扩增反成.上胶电泳,压片馥片3个步骤.I212变异受体基因在CHO细胞系上的稳定表达转染:取待转染的正确质粒5J%脂质体溶液(Lipofex.1amine)(2mgm1)40t*l,转染CHO细胞=37,5%c下堵养48h后,悬浮贴壁细胞于30mJ含潮霉索(3o0m)的MEM-a=IO中,分装于3个lOcm培养皿内,10n1】,皿,静置培养各受体表达细胞的荧光染色:取上述悬浮细胞5O(Ixl,管),加入l0(】0/m】)鼠抗人CXCR4单抗718,或鼠抗人CXCR2单抗,或兔抗人CXCR4胞外游离N端多抗室温放置25mln后,离心洗去一抗.于各管中分别加i0td(O.5)革抗鼠IgG-PE或羊抗兔lgC.PE放置25min后,洗涤细胞,每管中加入2O01%甲醛溶液固定细胞,于流式细胞仪检测转染情况.流式细胞仅检测转染细胞和分拣表达附陆细胞:染色并固定的细胞悬液经流式细胞仪检测,根据获得的细胞分布图(Histograms)提供的信息可由赢式细胞仪将表达阳性的细胞分拣出来.在后续的潮毒素B的选择力下培养这些分拣出的阳性细胞,能较快地获得稳定表达细胞株.RT-PCR法验证变异受体表达细胞:从细胞总RN中经逆转录,eDNA扩增和扩增产物测序证实细胞的正确表达.以TR1ZOL.试剂分别提取各受体表达细胞内总RNA:逆转录反戍引物为叫igo(drj1218,反应在扩增仪上进行(5560min,855mln),eDNA的PCR扩增引物为242一up-s,CXCR43XbaI(5TGCrCTAG.ArCGA3):941:变性3min后,进循环反应:94.c1mlu,52.c1,72.c】5删.30个循环后,72.c延伸JOmin,反应样品4保存:RT-PCR产物测序同前I22配体结合试骑方法l见文献5.不同的变异受体表达细胞为配体结台试验中的受体提供者.与SDF-tI和ISDF-1日进行结合实骑,观察各受体与其配体的结台能力.1.23细胞微生理监测术检测受体表达细胞的信号传导能力方法见文献5j.用SDF-10刺激备变异受体表达细胞,观察它们胞外酸化率(ECAR)的变化程度,并以此判断它们的信号传导能力.1.24细胞一细胞融合实验利用H的gplO与靶细胞上CO4和CXCR4/CCR5等趋化因子受体结台并引发H包膜与靶细胞膜融合的原理,在靶细胞(QT6细胞,引C1M基因,报道基因一r7及变异受体基因)上表达CIM及变异受体分子,在效应细胞(He细胞,引重组H嗜性包膜糖蛋白LAI基因和T7RNA多聚酶基因)上表达HIv的包膜蛋白复合体.将这婀组细胞共同孵育:细胞间融台致使报道基因lat,Z表达.由分光光度fig录底物加后系统产生的颜色的深浅,并以此来衡量细胞融合的程度,基本按文献7中方法进行.效应细胞的感染:以025%胰酶一DMEM悬浮HeLa细胞,用vCB-41(LA1),vTF1t感染细胞(对照组用vCB-16,vTFI.1感染).37,5%c孵育45min后,复加人生长培养基和利福平100m1,培养过夜.靶细胞的转染:用BES/磷酸钙法将peDNA31-一第2期郑虹,等.趋化罔子受体CXCR4的结构与功能187CD4,各wDNA3.I-变异受体,peDNA31-lall1各5f转染qr6细胞.35,3%CO,培养过夜.细胞融合:悬浮贴壁细胞使La细胞为Jxl,qr6细胞为2lff/ml一取两种细胞各100山,加人96孔板内,充分混匀37.5%c培养3h后,每UJiJ520%NP40终止反应从各扎取出50fl转A一新96孔板内.并加人50,dl4L2底物溶液(J%Chloro-md-galacoDxanodde).立即在读数2结果2.1变异受体表达细胞的建立经流式细胞仪测定表明,各稳定表达细胞株中分别有80%以上的细胞表达变异受件:表达细胞株的RT-PCR产物,见网2,表达变异受体的细胞只有在特异的引物指导下,才有预期大小的扩增产物出现.删序结果表明,除获得表达野生型CXCR4和CXCI细胞株外,获得了5个正确的嵌合受体,2个突变受体的稳定表选细胞株.它们的扩增产物有完全正确的核苷酸顺序2.2变异受体表达细胞的配体结合能力配体结合试验结果表明.在这些变异受体巾,有4个能与SDF-I结台,它们是2444a,4442,4222,CXCRTr其中4222和GXCR的解离常数Kd与野生型CXCR4无差别;男3个变异受体没有结合能力:它们的抑制曲线和Scatchard图见罔3图21%琼脂糖凝睦显示变异受体细胞的RT-pcR产物Fig21%耐DftbeRT-PcRpT0dlJmofofmarceaot删mLing7:Lttm【IKqAofthesmllnale.theproductis532bp;Lane8:totalRAl瑚1empCH)fdl舢template;LaneI.12ThRNAh啪lCXCR4andCXCR2exposingcells舶templatseparatelywL11slxdficpdnrthenlTheirMLuctsare【.1kb;I上】_35:ThaJRNAfr0mCXCR-%Tr.2442and2444aexpr.ingcellssepm【ytemplatwh哪spJprlnIh日nsbut110f盯us.Ij:I2.4.6:TolalRNAfGXCR4一Tr.2442aqllspa咖越tenqdatwh棚slxcificnns.d:Lane91O1RNAfrual42塑一preingcelltendswh.-T,eeifie(【一9j.andncstgific【I部e10)priIDadvCHI4222一SDF-J13/SDF-tB0I】【0BlC=【?L】0围3smql与CXCl蛮异体结合的结合抑制曲线厦Seatdmrd图(皆曲3次d上实验的范倒)Fig3TheahlbiflonturvesandtheSeateberdsoftwerydlarCXCR4阳rsthattmtldbeboundwithsDlptP,ezadtsof3sforORePIninhibitioneXaxleistheincrcomentration0fthepurifiedSDF-t.YispercenlsofthecpmratioforJndabsledSDFl3and,rximallalzeedboundSDF-taldiffernlpmntsclemtration(1rthepurifiedSDFIInSealchard,x出isthetc4t1boundSDb-】口,YaxleistheratiothetolalboundSDF-I,and1oralfreeSDF-I23各变异受体受SOVq刺澈后的ECAR的变化情况Cytosensor结果显示,2444a,CXCR4-Tr仍保留了信号传导的功能.虽然4442和4222能与SDF-I结合.却失去了信号传导的能力.见图4:如蛐牲0l88第三军医大学第23卷24变异受体在体外细胞一细胞融合反应实验中的表现与以往的结果基本相似.单独表达CIM,CXCR2,及CD4与CCR2共同表达时D数据显示没有融台发生,而当共同jg表达CD4和CXCR4时,融合反应强烈.除4222外,其它变异受体都程度不同地具有辅助受体的功能,见图5.各变异受体的特性与功能见表I.Tiniiihllltl|图4能与sa-1l结合的变异受体在受sDF_1B刺激后的ECAR的变化Fig4ECARmr懈ofthetellst.Iigdla_倒删岫t吼埘behoundwithsD】Bwhenactivatedwith20n咖L雾ReceplT图5各变异受体参与细胞-细胞融台反应后的报道基因产物在Dsso的相对于CXCR4之产物的吸收值ng5AhsorbamratiosalDofreporterprodutqsofeveryehaedreplor$yelJesCXCR4whenusedasamo甲t0rseparatelyindl-0e吐fusionassayEhbar.oplgtodemnlsuhswhendifferlteptutswemuLn血vexcplCIMbar,indchr目mu.InvCD-16bar.gd60tlLI)u忸nfu11H?highthel0is.thesfHmgthere】mis表1各变异受体的功能Tab1FunctionsofeverychangedCXCR4recepto一:11lthrongedfLXCR4has0L0%bi|itv1Eand一tivityceptorolCXCR4s.IInegativeTbIhalabove10e/ctledfLveT+70%100%CXCR4s;1:35%70%:10%35%3讨论综合结合实验及Cyoselaser的数据可以看出:当CXCR4的N端被CXCR2的相应片段所替代时(2444a).其结合SDF-13的能力较野生型CXCR4低,但信号传导能力却与CXCR4相似;当整个N端及第一跨膜区为CXCR2的相应区域所替代时(2444b),结合SDF.1B的功能完全丧失.当CXCR2的胞外N端为CXCR4的相应片段所取代时(4222).该受体获得与sT)F一18高亲和力的结合活性.但并没有给CXCR2带来与SDF-1B结合后的信号传导功能因此,CXCR4的胞外游离N端为SDF-I高亲和力结合所必需的.当2444a的第三胞外环链为CXCR2所替换时(2442).虽然其表达很高,但结合活性消失.4442与SDF-IB结合的亲和力较CXCR4低,但丧失了信号传导功能由此可见,虽然第三环链不是SDF.18的结合所必须.但从某种程度上可能参与形成稳定的高亲和相互作用的区域;该区域还可能参与结合后事件,如信号传导所需的构象变化整个胞内c端缺失(CXCR4.Tr)对其结合能力没有影响,但却大大削弱了其信号传导能力,故胞内c端,和第七跨膜区的某些部分(很可能是那些位于内膜附近的氨基酸残基)参与信号传导功能已经知道,胞内第二环上的DRY区是趋化因子受体与G蛋白复合体进行相互作用的关键.CXCR4-NAA是CXCR4上DRY盒的取代变异受体尽管它在细胞上有好的表达,但它不能与SDF-I结合.可能配体与受体高亲和力的结合需要受体在与G蛋白复合体耦联后形成或维持一种合适的构象改变DRY区域后,由于不能与G蛋白耦联,可能导致受体丧失形成与配体高亲和性结合所需的合适构象的能力.在用_r_嗜性H的重组包膜糖蛋白LAI参与体外细胞一细胞融合实验的情况下,CXCR4N端的加入替换并不能使第2期郑红,等.趋化因子受体CXCR4的结构与功能l89CXCR2获得辅助受体的功能(4222),因此单独的游离的端不能支持CXCR4的辅助受体功能;2444a和CXCR4.Tr的辅助受体功能与野生型CXCR4相差不明显,表明CXCR4的N端及胞内的c端不参与其辅助受体功能;而2444b,4442和2442,CXCR4.NAA的辅助受体功能均受到程度不同的影响,表明第一跨膜区,第三外环链及第六,第七跨膜区都程度不同地参与了CXCR4的辅助受体功能,而CXCR4的DRY盒的改变,也给印l2o的结合带来一定程度的影响.因此可以这样认为,CXCR4的胞外N端是其SDF-1口结合的主要参与结构区域,但这种N端所有的高亲和的结合能力并不能起动受体的信号传导除N端外,第三环链也与SDFl8的结合有关,且相对于N端而言可能是第二位的,但对于建立和维系高亲和力的结合和后续的信号传导则起着重要的作用.胞内的c端区域的缺失并不影响整个受体高级结构的形成,也和与SDF-I结合的功能,受体的辅助受体功能无关,但对受体的信号传导功能有直接影响.该功能区域与受体的配体结合功能区域是截然分开的.CXCR4上的保守序列DRY盒.在形成与配体高亲和力结合上具有重要的作用.CXCR4的配体结合功能结构域与其辅助受体功能结构域存在部分交叉重叠.这可以部分解释那些趋化因子抑制HW感染的作用机制,即趋化因子与辅助受体的结合以空间位阻干扰了HIVgpl20与其辅助受体的结合.同样,HIVgpl20与其辅助受体的结合也会以空间位阻干扰趋化因子与其受体的结合.由于这些趋化因子在免疫系统的功能行使中有重要的作用,因此,可以想象,HIV在侵入宿主细胞的第一步,就有可能开始起着打破趋化因子.趋化因子受体平衡,干扰免疫系统的作用.随着趋化因子及其受体的不断发现,并由于