蛋白检测篇9-FRET.docx

编号：1-9主题：荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)概述：荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间的相互作用。蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。目的：1.活细胞内检测蛋白激酶活性；2.细胞凋亡的研究；3.受体激活效应在细胞膜上的横向扩散；4.膜蛋白的定位修饰；5.细胞膜受体之间相互作用；6.细胞内分子之间相互作用。原理：荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：受、供体的激发光要足够分得开；供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。步骤：1 、实验所用细胞的培养；2 细胞转染质粒：CFP-A基因和YFP-B基因质粒；3 多光子共聚焦显微镜和 FRET 观察FRET 检测时间：CFP-A基因或YFP-B基因转染细胞 12h、18h、24h、36h、48h、72h 后检测 FRET。FRET 图像采集：确定 FRET 配对的激发波长， 蓝宝石激光被调谐分别用于探测最大和最小的供体和受体信号， 最大供体信号和最小受体信号对应的波长用于收集双表达细胞的 FRET 信号。标定 CFP （供体）和 YFP （受体），调整激光变化，以便获取最大 CFP 信号和最小 YFP 信号的激发光波长，以此激发（CFP-YFP）双表达细胞，选择合适的滤镜组合和高灵敏的 PMT， 采集供体和受体图像，收集 FRET 信号，调整供体激光强度，固定用于激发供体，对受体激发波长也类似要求，注意调整能量，使用合适的中性密度滤光片，避免光漂白。每个细胞 FRET 检测重复 3 次，每种转染至少完成 6 个细胞的 FRET 检测。FRET 数据处理： 去除 FRET 信号中 DSBT 和 ASBT 的光谱串色信号； 受