北京大学《药物毒理学》4药物毒理学-长期毒性试验

长期毒性 chronictoxicity 重复给药毒性 repeateddosetoxicity 北京大学医学部毒理学系姚碧云Tel 82801531 基本概念 长期毒性 重复给药毒性 repeateddosetoxicity 实验动物反复多次接触药物所引起的毒性反应 长期的期限主要取决于药物临床拟用的期限 一般为临床拟用期限的2 3倍 还应有适当的恢复期 包含了不同给药周期的毒性 即28天毒性 1 3个月毒性 6 12个月毒性 物质蓄积 materialaccumulation 实验动物反复多次接触化学物后 用化学分析方法能够测得机体内存在该化学物或其代谢产物效应 损伤蓄积 damage effectaccumulation 有的化学物在长期接触后 机体内虽不能测出其原型或代谢产物 却出现了慢性毒性作用 蓄积作用 accumulation 外源化学物进入机体后经过代谢转化排出体外 当其连续地 反复地进入机体 而且吸收速度超过代谢转化与排泄速度时化学物在体内的量逐渐增加 称为化学物的蓄积作用 如洋地黄 依米丁 溴化物或含汞 砷 铅中药等代谢缓慢而毒性较高 二 亚慢性和慢性毒性试验的目的 确定受试药物长期毒性的效应谱 毒性特点及靶器官 研究药物长期毒性的剂量 反应 效应 关系 确定其LOAEL和NOAEL 提出受试药物的安全限量参考值 研究受试药物长期损害的可逆性确定物种间的毒效应的差异 为将毒性研究结果外推到人提供依据 长期毒性试验方法TheMethodsofChronicToxicityStudy 实验动物的选择和染毒期限 染毒途径 试验分组和剂量设计 观察指标 一般选择两种实验动物 一种为啮齿类动物 另一种为非啮齿类动物 常用的实验动物 大鼠 狗 猴 一 实验动物选择和染毒期限 实验动物的选择 如果设计要求在染毒受试物期间处死一部分动物 进行某些指标动态观察 则在试验开始时应相应增加实验动物数 在药物临床前毒性研究中 长期毒性试验的期限主要取决于药物临床拟用的期限 一般为临床拟用期限的2 3倍 还应有适当的恢复期 实验动物染毒期限 中国SFDA ICH 原则 尽量模拟人类接触受试物的方式 途径 并且亚慢性与慢性毒性试验的染毒途径应当一致 常用 二 染毒途径 经胃肠道 最好采用经饲料或饮水喂饲法 也可以用灌胃方式染毒 经皮肤染毒 去毛部位面积 动物体表总面积的10 15 每次染毒4 6小时 注射途径 常模拟人使用途径 一般有静脉 肌肉 皮下注射 对于啮齿类 常以腹腔注射作为静脉的替代途径经呼吸道 亚慢性 每天吸入4 6小时 高剂量组 能引起较为明显的毒性作用 3个剂量组中剂量组 应为LOAEL低剂量组 应相当于NOAEL 阴性 溶剂 对照组 为了要得出明确的剂量 反应关系 和确定未观察到有害作用剂量 NOAEL 因此至少应设 三 试验分组和剂量设计 1 3个月毒性试验的剂量设计高剂量组急性毒性的阈剂量1 20 1 5LD50中剂量组低剂量组阴性对照组组距 3 10倍 最低不小于2倍 6个月毒性试验的剂量设计 高剂量组亚慢性毒性的MTD或其1 5 1 2 中剂量组 低剂量组 阴性对照组 组距 2 5倍 最低不小于2倍 1 以相同物种的毒性资料作基础 剂量范围研究 Range findingstudy 剂量范围研究设计 啮齿类 剂量范围研究设计 非啮齿类 剂量选择的一般步骤 如对剂量选择没有把握 则可在该次实验中多设几个剂量组 这比重复整个试验费用低得多 急性 单剂量毒性试验 剂量范围发现研究 90天毒性试验 急性 单剂量毒性试验 14 28天毒性试验 90天毒性试验 直接从急性毒性资料来确定慢性毒性试验的剂量经常有困难 可能高估或低估受试物的长期毒性 如资料来自相同物种 低剂量原则上应高于同种动物药效学试验或功能学试验的有效剂量 并不使动物出现毒性反应 如资料来自另一物种 应根据体表面积换算受试物种的药效学或功能学等效剂量 并据此设计低剂量组的剂量水平 2 药物或保健食品 以动物试验药效学或功能学资料作基础确定低剂量组水平开始设计 3 对于药物或保健食品 低剂量组应适当高于预期临床治疗或人拟用最大剂量的等效剂量 保健食品 100倍 化学药品 30倍 中药 50倍 4 当预期受试物无明显毒性时 长期毒性试验的最高剂量至少等于人拟用最大剂量的倍数 5 用以上几种方法进行亚慢性和长期毒性试验的剂量设计 结果也许会不一致 甚至会相差一个数量级 这时就需要根据以往试验的经验判断 或增加剂量组以保证得到良好的剂量反应关系 四 观察指标 1 一般性指标动物的外观 体表通道和毛色等 社会行为 躁动 冷漠 探究活动 刺激性 好斗 等体重 饲料消耗及食物利用率 2 实验室检查 血液学尿液临床生化3 眼科学检查4 血压和心电图的测量 通常限于非啮齿类 活体评价 In lifeevaluation 2 处死后评价 Post Mortemevaluation 1 尸体解剖 试验结束 活杀实验动物 采血进行上述实验室检查 并系统解剖 测定脏器重量 脏器系数 relativeorganweight 某个脏器湿重 体重的比值 100 肉眼可见的损伤或可疑损伤部位都应作进一步组织学检查 对照组和高剂量组动物以及系统解剖时发现的异常组织均需作详细的组织学检查 啮齿类动物36种 非啮齿类动物39种 在吸入毒性研究中 需检查整个呼吸道 经皮毒性试验应选取涂敷受试物部位的皮肤和相邻部位的皮肤 应评价器官组织病理改变的性质和发生率 如果病理组织学损害程度进行半定量评价 将易于判断损害是否由于受试物诱发的损害是否随染毒剂量和时间增加而严重 2 病理学检查 3 特异性指标 效应生物学标志 是反映受试物对机体毒作用本质的特征性指标 并常与其毒作用机制有关 4 指标观察时间 一般指标 每天观察一次 体重 饲料消耗量 每周一次 试验室检查 亚慢性毒性试验 试验结束时 必要时可在试验中间进行一次 慢性毒性试验 试验中期活杀少量动物及试验结束时 全面检测各项指标 数据处理和结果分析 DataProcessingandResultsAssessment 研究资料的汇总 计量资料 按组别 必要时按性别 进行汇总并求出每组的均数 标准差计数资料 用相对数 率 比 进行统计描述 求出每组的均数和标准差 统计学比较 根据数据类型选用合适的统计方法 进行各剂量组与阴性对照组的比较 统计学意义 生物学意义 毒理学意义 判别处理组与对照组间差别有生物学意义应考虑的因素 剂量依赖性趋势剂量 反应关系是反映效应与处理因素相关最重要的指标之一 如果剂量组与对照组结果之间存在差异 并且效应的大小随剂量水平的增加而改变 可判定效应与受试物有关 结果的重现性试验结果可以重复 基本可以确定与受试物有关 相关的发现与对照组比较 处理组某项指标的变化 伴随着相应的指标变化 这种效应可能与处理有关 差别的大小和类型处理组与对照组间差的大小及类型 也提示此差异与受试物处理可能的关联 两种性别的一致性 如果在对照组与处理组之间的差别是真实的 需回答这种差别是否代表有害作用 差别的大小是关键问题 生物学意