rhEPO对卵巢癌HO8910细胞表面TfR表达及细胞增殖的影响.doc

rhEPO对卵巢癌HO8910细胞表面TfR表达及细胞增殖的影响作者：杨泽敏,马沐雅,冯玫单位：山西医科大学，山西 太原 030001【摘要】目的：通过卵巢癌HO8910细胞表面的TfR(CD71)在rhEPO干预前后的表达情况来观察rhEPO对细胞增殖的影响，探讨其在肿瘤相关性贫血中的治疗价值。方法：用RTPCR法检测经不同浓度的rhEPO处理后的和未经rhEPO处理的HO8910细胞表面的TfR mRNA表达情况：用流式细胞仪观察和检测处理前后的HO8910细胞周期上的差异。结果：不同浓度的rhEPO培养HO8910细胞48 h，72 h后，TfR表达均减少，与同期对照组相比差异有显著意义(P0.01)；经不同浓度的EPO在不同时间处理后的HO8910及未经EPO处理的HO8910在细胞周期上，与同期对照组相比差异有显著意义(P0.01)，且较对照组有所减少。结论：经过高浓度的rhEPO处理后，卵巢癌HO8910细胞表面TfR的表达减少，S期细胞百分率也有所降低，间接提示了高浓度的rhEPO可能通过铁代谢抑制卵巢癌HO8910细胞的生长、增殖。 【关键词】 EPO；TfR：孵巢癌；贫血；细胞增殖 Effect of rhEPO on the expression of TfR residing on the surface of human cancer cell line HO8910 and the proliferation of cell YANG Zemin1，MA Muya1，FENG Mei2 (1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.The People′s Hospital of Shanxi Province，Taiyuan 030012，China) Abstract Objective：To detect the expression of TfR residing on the surface of the HO8910 cultured with EPO and cultrured without EPO，accordingly to observe the effect of EPO on the proliferation of human cancer cell line HO8910，and approach the mangagement value of EPO.Methods：To detect the expression of TfR residing on the surface of the HO8910 cultured with EPO and without EPO by RTRCR.To detect the difference of cancer cell cycle by FCM.Results：The expression of TfR of the HO8910 cultured with EPO decreased to that of the HO8910 cultured without EPO，and it had statistical singificance.The percentage of the S cell cycle of the HO8910 cultured with EPO did not decrease to that of the HO8910 cultured without EPO.Conclusion：The high concentration of EPO might repress the HO8910 proliferation. Key words EPO；TfR；ovarian cancer；anaemia proliferation 肿瘤相关性贫血普遍存在且明显影响患者的生存质量。随着分子生物学技术的发展，rhEPO的问世及临床应用，为肿瘤相关性贫血的治疗提供了一条新途径。目前的临床研究印证了rhEPO作为输血的替代疗法对肿瘤相关性贫血治疗的有效性和安全性，但是近年研究发现，除了红细胞系统外，多种肿瘤细胞表达EPOR1，2，而且报道EPO对白血病细胞株体外实验有增值反应3。 为了进一步探讨rhEPO对肿瘤细胞是否有增殖作用，我们的实验研究从与细胞增殖相关的抗原TfR的表达情况以及HO8910细胞周期的差异出发，探讨rhEPO对HO8910细胞表面TfR表达及细胞增殖的影响。 1 资料与方法 1.1 材料 实验用人卵巢癌细胞株HO8910由山西医科大学中心实验室提供。EPO是由沈阳三生制药有限责任公司提供。TfR mRNA在HO8910细胞表面表达用RTPGR方法测定。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。PCR扩增仪为美国PE公司提供。流式细胞仪为美国BD公司提供。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 HO8910细胞在复苏后用RMPI1640培养基加10胎牛血清在37，5CO2环境下常规培养。稳定传代2 d后备用。 1.2.2 流式细胞仪(FCM)方法 HO8910细胞稳定传代2 d后，取6瓶HO8910细胞，加入含有浓度分别为50，100，200 U/mL的EPO的培养基继续培养，作为实验组。同时以2瓶没有加EPO的HO8910细胞为对照组。分别在48 h和72 h后，用离心沉淀法收集各培养瓶中的细胞，按照流式细胞仪检测细胞周期专用试剂盒的操作说明，送流式细胞仪进行细胞周期的测定。以上步骤重复3次，取其平均值，不同浓度的EPO不同时间对HO8910细胞的细胞周期的影响见表1。 1.2.3 RTPCR扩增 详细方法按试剂盒说明书，引物序列如下： 上游引物5GGAGGAGCCAGGAGAGGGACTT3′。下游引物5CTCAGCAAAGTCTGGCGTGAT3′。产物长度为226bp，取2 μL反应液，用1.5琼脂糖凝胶电泳照相分析。结果见表2。 1.3 统计学方法 FCM方法的结果以细胞进入S期的细胞比例表示出来，RTPCR扩增HO8910细胞表面的TfR，以TfR mRNA扩增带与β肌动蛋白扩增带的灰度比值为TfRmRNA表达的相对值，结果用±s表示，利用统计软件SPSS11.5for Windows进行析因设计的方差分析，LSDt检验对数据进行统计学处理，检验水准取a0.05。 2 结 果 2.1 流式细胞仪(FCM)方法 不同浓度的EPO不同时间对HO8910细胞的细胞周期的影响(见表1)。表1 不同浓度的EPO不同时间对HO8910细胞的细胞周期的影响S期细胞百分率同一时间点实验组与对照组相比P0.01。2)实验组之间两两相比P0.05。 实验结果显示：经不同浓度的EPO处理组在48，72 h这两个时间点，与对照组相比时，P0.01，且经不同浓度的EPO处理组的S期细胞百分率较对照组有所减少，但不同浓度处理组之间没有统计学差异。对于同一浓度的EPO处理组在不同时间点相比，P0.05。 2.2 RTPCR扩增 不同浓度的EPO不同时间对HO8910细胞表面的TfR表达的影响(见表2)。表2 不同浓度的EPO不同时间对HO8910细胞表面TfR表达的影响TfR mRNA表达的相对值同一时间点实验组与对照组相比P0.01。2)实验组之间两两相比P0.05。 实验结果显示：经不同浓度的EPO处理组在48，72 h这两个时间点，与对照组相比时，P0.01，且经不同浓度的EPO处理组的TfR mRNA表达的相对值均较对照组有所减少，但不同浓度处理组之间没有统计学差异。对于同一浓度的EPO处理组在不同时间点相比，P0.05。 3 讨 论 肿瘤患者一旦出现贫血，将严重影响患者的生活质量，是影响其预后的一个重要因素。纠正肿瘤相关性贫血可以显著改善患者的生存质量，因此，提倡将肿瘤相关性贫血的治疗作为肿瘤整体治疗的一部分46。过去，改善贫血的传统办法是输血，然而输血存在着很多潜在危险，如效果差、费用高、血源缺乏等，输血的免疫抑制问题也被Heiss等7的随机分组研究证实。结果显示，输异体血患者的局部肿瘤复发的危险性明显高于输自体血的患者(P0.001)，而EPO能减少这些危险。 在妇科恶性肿瘤治疗中，EPO的应用越来越受到重视。EPO/rHuEPO用于合并贫血的妇科恶性肿瘤患者可以为这类患者完成化疗提供保障。Kurz等8将35 例联合化疗同时皮下注射rHuEPO 150 U/kg，每周3次，连用12周，如在用药的第4、8、12周测定血红蛋白水平，增加20 g/L或Hb120 g/L认为有效，需输血(Hb80 g/L，RBC3×1012/L，临床表现为贫血)则为无效。结果显示，治疗组有效率为56.6，仅有5 例患者需输血，而对照组66.6的患者需输血，而且治疗组rHuEPO有效患者体力较用药前明显增加。 近年来随着对EPOR与EPO的深入研究，发现EPO的作用不仅仅限于红系细胞。国内学者周密等9的近期研究发现：不同浓度的rhEPO处理白血病细胞(K562细胞)72 h均能显著增加CD71抗原的表达，另外研究还发现用rhEPO处理K562细胞后可使S期细胞百分率上升，进而促进细胞的生长和增殖。 Mittelman等10研究表明在大鼠骨髓瘤模型中大剂量应用不但不会促进肿瘤生长，反而诱导肿瘤缓解，延长存活期，降低死亡率。可能是增高的能促进肿瘤内部氧化，从而改善低氧对肿瘤生长、转移、治疗耐药的有害影响11。 那么针对rHuEPO对肿瘤细胞的增殖作用是否产生一定影响，在本实验中决定从与细胞增殖相关的抗原TfR的表达水平及细胞周期出发，以卵巢癌细胞株为对象，对EPO在临床的实用价值进行进一步的研究。研究结果提示HO8910细胞表面有FfR mRNA的表达，这是该种细胞表面有TfR存在的间接证据。其次本实验设定的EPO浓度梯度远远大于临床用药的浓度范围，实验浓度比临床用药浓度高1万倍以上，如表2的结果显示：在48，72 h这两个时间点，与对照组相比，经不同浓度的EPO处理组的TfR mRNA表达的相对值均较对照组有所减少，但不同浓度处理组之间没有差异。因此这一结果说明EPO并没有促进HO8910细胞增殖的作用，而且提示了高浓度的rhEPO抑制HO8910细胞表面TfR的表达。其次表1的结果显示经过高浓度的rhEPO处理后，HO8910细胞较对照组进入S期的细胞百分率减少，不同浓度处理组之间没有差异，这与实验中TfRmRNA表达情况是相符合的。由于肿瘤细胞对铁的需求高，因此对铁的摄取率高，铁代谢活跃，TfR的表达相应增加，那么细胞内参与DNA合成的铁增多，使进入S期的细胞相应增多，从而促进肿瘤细胞的增殖。但在实验中经过高浓度的rhEPO处理后，HO8910细胞表面TfR的表达减少，铁的摄取率降低，进入S期的细胞减少，这种铁剥夺状态可以抑制肿瘤细胞的生长，是不利于肿瘤细胞的增殖的。 因此本实验研究的结果表明：rhEPO可能通过参与HO8910细胞的铁代谢过程，直接或间接地抑制细胞的生长、增殖。因此，对于临床应用rhEPO治疗肿瘤相关性贫血时，我们不仅没有找到rhEPO对肿瘤细胞有增殖作用的直接证据，反而从实验研究的角度出发更加进一步肯定了其在肿瘤相关性贫血中的治疗价值。但rhEPO参与和调节细胞铁代谢过程的机制值得进一步深入探讨。【参考文献】1 Kanoori S，Akihiro T.Expression of erythropoietin receptors on acute leukemia cells and their response to erythropoietin in vitroJ.Jpn J Cancer Res，1996，87(9)：422423.12 樊华，金峰，陈波，等.EPOR/HRas介导的白血病细胞系增生信号转导机制的研究J.白血病•淋巴瘤，2003，12(3)：1517.13 FAN Hua，Suk Ida，Kan Ji，et al.Analyse the expression of EPOR and function in leukemic cell lineJ.Journal of Leaukemia，2000，9(2)：98100.14 Itri L M.Managing cancer related anaemia with epoetin alfaJ.Nephrol Dial Transplant，2002，17(Supp1 1)：7377.15 Quirt I，Robeson C，Lau C Y，et al.Canadian eprex oncology study group：epoetin alfa therapy increases hemoglbin levvels and imprves quality of life in patients with caner related anemia who are not receiving chemotherapy and patients with anemia who are receiving chemotherapyJ.J Clin Oncol，2001，19(21)：4 1264 134.16 Witig T E，Siberstein P T，Loprinzi C L，et al.Phase ，randomized，doubleblind study of epoetin alfa versus placebo in animic patients with caucer undergoing chemotherapyJ.J Clin Oncol，2004，23：2 6062 617.17 Heiss M M，Memple W，Delanoff C，et al.Blood transfusionmodulated tumor recurrence：first results of a randomized study of autologous versus allogeneic blood transfusion in colorectal cancer surgeryJ.J Clin Oncol，1994，12(9)：1 8591 867.18 Kurz C H，