实验二细胞凝集反应

实验二 细胞凝集反应,一、实验目的,学习研究细胞凝集反应的方法,了解细胞发生凝集反应的原因。了解颗粒性抗原与可溶性抗原凝集反应的原理。,二、实验原理,红细胞凝集包括由病毒、细胞凝集素和抗体而引起的三种类型的细胞凝集现象。 凝集素（lectin）是从各种植物的种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖蛋白，因为能凝集红细胞，故名凝集素。 凝集素最大的特点是能识别糖蛋白和糖脂，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞表面的糖基。通过与细胞表面的糖分子相连，在细胞间形成桥，从而引起细胞的凝集。一种凝集素通常只对某一种特异的糖基具有特异结合的能力。,如刀豆素A与吡喃糖基甘露糖结合，马铃薯凝集素专一结合的是N-乙酰氨基葡萄糖二聚体和N-乙酰氨基半乳糖。加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集作用。 另外，凝集素还具有多价结合的能力，能与荧光素、酶生物素、铁蛋白、胶体金结合而不影响其生物活性，可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究。,三、相关理论知识,颗粒性凝集反应（agglutination）是一种血清学反应。颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电介质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。,1.直接凝集反应,颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。分为玻片法和试管法。 1)玻片法是一种定性试验方法。可用已知抗体来检测未知抗原。若鉴定新分离的菌种时，可取已知抗体滴加在玻片上，将待检菌液一滴与其混匀。数分种后，如出现肉眼可见的凝集现象，为阳性反应。该法简便快速，除鉴定菌种外，尚可用于菌种分型、测定人类红细胞的ABO血型等。,2)试管法是一种定量试验的经典方法。可用已知抗原来检测受检血清中有无某抗体及抗体的含量。用来协助临床诊断或供流行病学调查研究。操作时，将待检血清用生理盐水连续成倍稀释，然后加入等量抗原，最高稀释度仍有凝集现象者，为血清的效价，也称滴度，以表示血清中抗体的相对含量。诊断伤寒、副伤寒病的肥达氏反应（Widaltest）、布氏病的瑞特氏反应（Wright test）均属定量凝集反应。,2.间接凝集反应,将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用。在有电介质存在的适宜条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。用做载体的微球可用天然的微粒性物质，如人（O型）和动物（绵羊、家兔等）的红细胞、活性炭颗粒或硅酸铝颗粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯胶乳微球等。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足以出现肉眼可见的反应，敏感性比直接凝集反应高得多。,四、实验用品,1、器材和仪器仪器：电子天平，大烧杯，小烧杯，显微镜，移液器，离心机，玻璃棒，镊子。耗材：10ml小试剂瓶，载玻片，盖玻片，1.5ml离心管，擦镜纸，吸头。2、材料： 马铃薯块茎、鸡血,2、实验试剂： PBS缓冲液：称取7.2g NaCl ，1.48g NaH2PO4 ，0.46g KH2PO4 ，用蒸馏水定容至1000ml，调pH为7.2。生理盐水：称取0.9g NaCl加水定容至100ml。3.8%柠檬酸钠溶液：称取3.8g柠檬酸钠（或是4.33g带结晶水的柠檬酸钠）加水定容至100ml。,五、实验步骤,1、凝集素的制备：用电子天平称取2g去皮土豆块茎，加10ml PBS缓冲液在烧杯中浸泡2h，粗提液中即含有土豆凝集素。2、2%鸡血红细胞的制备 用烧杯取5ml 3.8%的柠檬酸钠溶液，取一只鸡的鸡血于烧杯中，不断轻轻搅拌防止血凝。（注：一只鸡的血大约50ml左右，按10%的用量加入3.8%的柠檬酸钠。）, 用1.5ml的离心管取血液0.5ml，2000rpm离心5min，用移液器轻轻吸取上清去除；加入1ml生理盐水清洗红细胞，2000rpm离心5min，重复洗23次（注：从离心机内拿出离心管时切勿震荡，不要倾倒离心管倒上清，以免红细胞流出。清洗红细胞时轻缓颠倒离心管或用移液器缓缓吹吸悬浮红细胞，防止红细胞破裂）。, 在1.5ml的离心管中加入0.98ml生理盐水，混匀，即是2%的红细胞悬液，贴上标签备用（注：吸取红细胞加入试剂瓶时可吸取生理盐水清洗几次吸头，使得红细胞全部在悬液中）。,凝集反应现象用移液器吸取红细胞悬液，在三片载玻片上各滴一滴（50ul），其中一片加一滴土豆凝集素（50ul），一片再加一滴（50ul） PBS缓冲液，充分混匀，另外一片只有红细胞悬液（100ul），做空白对照，3-5分钟后盖上盖玻片，待干后于显微镜下观察血细胞凝集现象（注：红细胞悬液放置一段时间会发生沉降，取用之前应当轻轻摇匀）。,六、实验结果与分析,1、肉眼观察实验结果图1 左边是血红细胞加PBS缓冲液；中间是血细胞加凝集素；右边是血红细胞悬液（如图1所示，加土豆凝集素的血红细胞在肉眼下明显可以看到红细胞发生凝集，未加土豆凝集素的红细胞则没有变化，加入PBS缓冲液的红细胞可以保存时间较长。）,鸡 血 红 细 胞,未凝血,2、显微镜下观察实验结果,凝血,图2 左图为红细胞未发生凝集，右图为加入土豆凝集素红细胞发生凝集如图左所示，显微镜下观察到红细胞是分散的；加入土豆凝集素后红细胞就发生凝集，由于许多的红细胞凝集，重叠一起使得颜色变得更深。,七、注意事项及改进（1）离心机使用时，要将配平后的离心管对称放置在离心机内，禁止未配平就放入离心机和非对称放置离心管。（2）从离心机内拿出离心管时切勿震荡，不要倾倒离心管倒上清，以免红细胞流出。清洗红细胞时用移液器缓缓抽打，防止红细胞破裂。（3）红细胞悬液放置一段时间会发生沉降，取用之前应当轻轻摇匀。（4）红细胞长