分子生物学(余爱丽)第八章prok基因表达调控

第8章Prok基因表达的调控 第一节相关概念及操纵元调控花式概述第二节乳糖操纵元 LacOperon 第三节TrpOperon及弱化作用机理第四节基因转录的时序调控第五节Prok 翻译水平的调控第六节DNA序列重排对基因转录的调控 第一节相关概念及操纵元概述 代谢调控过程是自身生存和繁衍所必须 Prok 和Euk 都有各自准确调节基因表达的机制 基因表达 geneexpression 基因表达调控 generegulationorgenecontrol 任何影响基因转录过程和翻译过程的开启 关闭和这两个过程速率的较为直接的因素及其作用 涉及 RNA转录的开 关 数量 选择性加工蛋白质翻译速率 数量 加工与降解和分泌 Prok 和Euk 的调控极其相似 调控机制 核酸分子间的互作 核酸与蛋白质分子间的互作 蛋白分子间的互作 调控层次 DNA水平的调控转录水平上的调控 转录后水平的调控 mRNA加工成熟水平上的调控 翻译水平上的调控 翻译后水平的调控 共同的起源与共同的分子基础 转录水平上的调控是最为经济 灵活 又是最为重要 复杂的调控 a 在复杂的基因组内 确定需要基因转录的起始位点 b 精细调节基因表达的水平 以保证生物体对环境的适应 c cisfactor transfactor间严格而又灵活的互作 d 保证RNApolymerase的进行式转录 不中断 准确终止 生物遗传信息的概念 GenomeDNA 遗传信息的两大类别 II类 特定DNAseq 特定蛋白质 核酸结合 内在信息内 外 信号分子 结合信息 ORFonlyHelix Ntseq 遗传信息存在于模版链三维空间结构 DNA序列的一级结构上 IR Box paracodon 三联体密码空间 调控密码 钥匙与锁 简并简并 摇摆同工受体 遗传信息表达的方式 Euk 组成型表达 constitutiveexpression Housekeepinggene 诱导型表达 inducibleexpressionbysignalingmolecular Luxurygene 顺 反因子间互作方式的基因表达调控 顺式作用元件 cis actingelement 对基因表达有调节活性的DNA序列 只影响与其同处一个DNA分子或物理上相连的DNA上的基因 反式作用因子 trans actingfactor 与顺式作用元件相互作用影响基因表达的蛋白因子 其编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不一定在同一个DNA分子上 操纵元 Operon Prok 中 基因表达调控的一个完整单元 包括结构基因和控制区 O P 以及调节基因的整个核苷酸序列 操纵元中各结构基因按一定比例协调翻译 具有极性突变效应 操纵元中一个近基因的无义突变能够影响远基因表达 且根据距离远近呈极性梯度效应 P O紧密连锁或彼此重叠 I基因位点不固定 顺式作用元件 反式作用因子 正调控系统 没有调节蛋白存在时 结构基因是关闭的 而加入有活性的调节蛋白后 结构基因的表达活性被开启 无辅基诱导物或激活物 负控制系统 没有调节蛋白存在时 结构基因是开启的 加入这种有活性的调节蛋白后 结构基因表达活性被关闭 阻遏蛋白 所谓 关闭 指表达水平很低本底水平的基因表达 1 2个mRNA分子 细胞周期 开启 也常有程度的差异 操纵元的调控体系 负调控系统正调控系统 诱导阻遏 基因表达调控的分子机制 1 调控蛋白质的对称性与其识别序列的对称性 调控蛋白都是同种分子的多聚体 二聚体 四聚体 二倍旋转对称 通过单体和多聚体间的平衡迅速作用 于特异识别位点之间提高调控作用的特异性 反向重复序列 inmajorgroove 特异和非特异结合力 2 调控蛋白的DNA结合结构域的主要花式 主要有 螺旋 转角 螺旋 HTH Cys Cys锌指Cys His锌指 调控蛋白上存在与DNA和其它蛋白质相互作用的位点 螺旋 转角 螺旋 两个 螺旋被一个 转角隔开 一个螺旋起识别结合DNA的作用 3个 helix H1与H2平行H2与H3形成HTHmotifH3位于大沟中 与DNA特异结合 C 蛋白N端有五个螺旋 螺旋2和3与DNA相互作用 C端负责二聚体形成N端负责与DNA接触 锌指结构概念 与DNA结合的蛋白质中一小组保守AA与一个Zn2 结合起来形成蛋白质中一个相对独立的结构域 按结合的AA不同有两种类型 a Cys His C2 H2 锌指经典的锌指蛋白 中部芳香族氨基酸保守 加上Zn 和Cys和His之间的配位结构形成疏水核 经典的锌指蛋白 类固醇受体 激素 不同锌指蛋白中锌指数目多少不等 锌指可以串联重复排列 两指间7 8aa TF A有9个锌指 通用转录因子SP1有三个 经典锌指的三维结构 一个 折叠和一个 螺旋 锌指上的 螺旋负责与DNA作用 b Cys Cys C2 C2 锌指类固醇受体 Zn 与4个Cys残基形成配位键 Cys Cys 糖皮质激素受体 ZYJ272 3 调控蛋白与蛋白质结合的方式 1 HLH结构特点 长40 50个AA残基中含有两个既亲水有亲酯的 螺旋 被不同长度的连接区隔开 环 此类蛋白借助两个螺旋对应面上疏水基团的相互作用形成二聚体 同种或不同种亚基 鉴定的较清楚的蛋白质与蛋白质相互作用的结构基元有 螺旋 环 螺旋 HLH Leu拉链 HLH基元附近有个高度碱性的区段为结合DAN所必须bHLH 2 Leu拉链 蛋白上含有4或5个精确的相距7个AA的Leu残基 概念 调控蛋白上富含亮氨酸残基的结构域参与形成二聚体 Leu出现在 螺旋疏水的一侧 并直线排列 于是 两个蛋白分子的两个 螺旋之间依赖Leu残基之间的疏水作用形成一条拉链 Leu拉链区的氨基端约30个残基的碱性区与DNA结合 Leu拉链作用形成Y型结构 拉链为茎 碱性区分叉对称成臂 拉链蛋白的目标DNA为没有间隔的反向重复 第二节乳糖操纵元 一 乳糖操纵元 1961Jacob Monod 法国 1 结构 2 调节基因I 产物为阻遏蛋白 四聚体为活性形式 转录方式为组成型转录 LacI的表达效率很低 原因 其启动子与RNApol的亲和性很低 阻遏蛋白有两个结合位点 操作子位点 诱导物位点 二 LacOperon的负调控 1 细胞内无诱导物时 呈阻遏状态 阻遏蛋白和操作子的结合 影响了RNApol在 10序列上形成开放型的启动子复合物 2 细胞内有诱导物时 呈诱导状态 诱导物与阻遏蛋白迅速结合而改变其构象 从O上解离 RNApol 3 诱导物 异乳糖 allolactose 乳糖进入细胞后 由 半乳糖苷酶催化产生 半乳糖苷酶来源于乳糖操纵元的本底组成型合成 RNApol利用LacO处于游离状态的瞬间进行转录 阻遏蛋白与LacO有10min 20min的结合半衰期 一个mRNA 细胞周期 安慰诱导物 义务诱导物 可诱导半乳糖苷酶产生但不是其底物 IPTG 异丙基 D硫代半乳糖苷 TMG 巯甲基半乳糖苷 ONPG O 硝基半乳糖苷 4 阻遏蛋白与操作子的相互作用 硝酸纤维素膜结合试验 IPTGLacOC IR序列以 11为对称轴两边为两段各6bp的重复序列 11 5到 17之间 大部分在左侧 操作子的结构 LacRepressor tetramer 三 LacOpreon的正调控 CAP cAMP复合物 cAMP CAP蛋白 cAMP Lowglucose highcAMP 总结 lacoperontranscription controlregion 第三节TrpOperon及弱化作用机理 一 结构 结构基因 末端 终止子trpt 依赖 trpt 不依赖 相距很远的trpR编码阻遏蛋白其活性形式为四聚体 并且只有结合trp时才有活性 控制区域 P O和前导区及弱化子 trpO与trpE之间的162bp的前导区可转录到mRNA中 trpO的结构 位于trpP内 20bp 有完美的IR序列 trpP有正常的 35和 10区 10区完全在trpO内 二 阻遏调控机制 无trp时 有trp时 无活性 弱化作用控制 基因转录的翻译调控 通过核糖体对前导区的翻译而对转录进行调控 弱化子 attenuator TrpOperon中trpE前的一段非结构基因的对应序列 123 150 其中包括不依赖 因子的终止子 由于翻译的作用使转录终止 这段序列称为 衰减子 发现 缺失增加结构基因的表达 且与阻遏蛋白无关 弱化子调控的表现 与阻遏蛋白的负调控结果类似 无trp时 所有RNApol都能通过弱化子 有trp时 部分逃过阻遏蛋白监督的RNApol在弱化子处大部分被扣留 而只有10 能通过 1 TrpOperonmRNA的前导序列结构 下游 14aa的前导肽的ORF 其中两个相连的trp的codonUGG 60位 对弱化作用的实现起重要作用 下游长28bp的不依赖 因子的终止子为弱化子的核心部分 前面有核糖体结合位点 S D序列 2 前导序列的二级结构决定RNApol在弱化子处是终止转录还是继续转录 1和2 3和4配对 序列1和2 3和4配对时 RNApol在3 4区的不依赖 因子的终止子处终止 其后的trpE等基因表达受到限制 翻译作用不存在时或顺利进行 2和3配对 序列2和3配对时 RNApol继续转录 使前导序列后的结构基因得以转录 3 弱化子弱化控制的机制Prok 无核膜 转录和翻译偶联 1 细胞缺少trp Trp tRNATrp水平低 核糖体停顿在两个邻近的Trp密码子处 此时核糖体占据序列1 此时序列4还没转录出来 序列2和3有机会配对 RNApol可通过弱化子 3 此外 Arg饥饿时有相同的后果 2 当细胞有Trp时 Trp tRNATrp水平很高 核糖体顺利地翻译出前导肽而在终止密码子处 70 UGA位于序列1和2之间 解离 此时 核糖体占据了序列1和部分序列2 使序列2不能有效地和序列3配对 因而序列3和4产生终止子发夹结构 转录终止 实现弱化子对转录的调控关键是时间和空间上的巧妙安排 空间上 两个Trp的codon位置至关重要 时间上 核糖体停顿在两个Trpcodon上时 序列4还没转录出来 否则 这种巧妙安排的一个原因就是RNApol在转录完 90序列处时产生一次延宕给与核糖体以追赶的机会 5 Prok 中弱化子 衰减子 的普遍性 许多负责氨基酸合成的operon都受弱化子的控制 尤其是Hisoperon中 弱化子是唯一的调控机制 第四节基因转录的时序调控 时序调控 Prok 在生长发育的各个阶段 基因的表达是按照一定的时间顺序而展开的 如 噬菌体的复制和颗粒的包装 有效利用能源避免浪费 避免了某些基因表达时机不当所带来的危害 是多种蛋白质与RNApol作用的结果 一 枯草杆菌中 亚基的替换 1 枯草杆菌中phageSPO1早 中 晚期基因表达的转换 早期基因 寄主的RNApol全酶 55 早期基因28编码的gp28取代 55 含有gp28的全酶转录中期基因 中期基因33 34编码的gp33 gp34取代gp28 以gp33 gp34为 亚基的全酶转录晚期基因 2 枯草杆菌孢子形成过程中 亚基的替换 二 phage裂解性生长和溶源状态的调控 phage进入寄主体内后环化 其中 裂解周期 环形分子大部分基因表达 溶源状态 以线性分子形式整合到寄主的染色体上 使大部分基因不表达 Phage的操纵元组织情况 一 phage裂解生长过程中的基因表达 进入寄主cell的 phage的DNA上没有任何调节蛋白 因此寄主的RNApol便结合于PL和PR 1 抗终止蛋白PN和调节蛋白Cro首先被转录 2 PN蛋白的作用导致PL和PR控制的迟早期基因的表达表达产物C 蛋白 C 蛋白 O蛋白 P蛋白 Q蛋白 3 PQ蛋白的作用导致PR 控制的晚期基因的表达表达产物头尾蛋白 溶菌酶蛋白 二 溶源途径 巧妙的调控 小区段表达 整合到寄主染色体上 此外 C 促进Pint启动子转录 使intgene表达产生整合酶 1 溶源化的建立 PE启动子的转录 C C 蛋白共同确立PE处C 的转录 左向 PE EstablismentPromoter C 阻遏与裂解生长有关基因的转录 其中转录出的C mRNA含有S D序列 因此有很高的翻译活性 N蛋白和Cro蛋白被转录 N蛋白抗终止C C 蛋白被转录 C 作用于PE PRE 转录C 阻遏蛋白结合于OROLC 导致自身从PRM处转录 C C 蛋白是C 合成的正调控因子 作用于PE处 C 是关键 Cro蛋白间接抑制C C 的转录 直接阻止C 的转录 2 溶源化的维持 PM启动子的转录 已产生的整合酶使 整合并实现溶源化 attp attB 溶源化的维持需要低水平的C 转录 保持自身阻遏循环 这个功能由PM完成 C 蛋白对PM正调控 但PM起始转录的C 没有S D序列 因此翻译效率很低 但足以维持溶源状态 溶源状态的维持通过C 蛋白结合于OL OR上而实现 溶源周期 3 C C 蛋白对C 和Cro的影响 C 和Cro是 phage的两种调节蛋白 其中Cro能关闭C 的表达 溶源化状态的进入与否靠二者结合操作子的情况决定 数量是谁占上风的关键 二者与操作子的亲和次序为 C 蛋白OL1 OL2 OL3OR1 OR2 OR3 Cro蛋白OL3 OL2 OL1OR3 OR2 OR1 结合的结果阻止PL和PR的转录 C C 蛋白是C 和Cro蛋白谁占上风的关键 因为 在C C 的帮助下C 表达而Cro蛋白远早于C 蛋白的表达 OL1和OR1分别与PL和PR重叠 即 C 阻遏二启动子的能力强 正常情况下 寄主的hfl基因产物大量存在导致Cro占上风因为hfl编码一种蛋白酶水解C 此时Cro蛋白对左右两个早期操作子亲和力的差异 使两个操纵元初期表达一段时间才关闭 因此产生足够的O P蛋白 复制有关 和PQ 从而使菌 4 导致溶源化的因素 1 营养耗竭 寄主能源濒临枯竭时 导致cAMP产生等一系列生理变化 cAMP对hfl基因负调控 使分解C 蛋白的酶大大减少 C 又能抑制该酶 因而C C C 体走向裂解 2 MOI值过高 10 MOI指感染时 噬菌体与细菌的比例 称感染复数 C 蛋白其作用的形式是寡聚体形式 单体不稳定无活性 一两个噬菌体感染寄主时 产生的C 不足以形成寡聚体 MOI值过高时 足够C 寡聚体产生 确立从PE转录C C mRNA的高翻译活性导致C 数量占上风 PE活跃转录的同时抑制了Cro基因的表达 由于C 和操作子亲和力情况 导致C C 不再表达 但由于C 对PM的正调控 产生能够维持溶源状态数量的C 5 溶原状态 溶菌状态溶原菌受到紫外线等作用 细胞中recA蛋白获得蛋白酶活性 水解 阻遏蛋白 RNA聚合酶与两个早期操纵元的启动子结合 转录翻译出N和Cro蛋白 迟早期基因OPQ蛋白表达 晚期基因表达 第五节翻译水平的调控 翻译的调控主要发生在翻译的起始阶段 基因表达时翻译的效率主要取决于mRNA的一级结构和高级结构 因此 mRNA的翻译起始区域往往是调控的靶位点 结构状态 一 反义RNA的调控作用 反义RNA 又称干扰mRNA的互补RNA 简称micRNA mRNA interferingcomplementaryRNA 指与靶mRNA具有互补序列的调控RNA 通过互补的RNA序列与特定靶mRNA结合 起负调控作用 属于核酸与核酸的相互作用 作用机理 例如 1985Hoopes等人发现的 噬菌体C 抑制晚期基因的转录就是通过micRNA起作用 Q基因有一个依赖于C 的启动子PaQ 抗Q 其转录方向与Q基因相反 即转录产物RNA与Q基因的5 端的一半完全互补 从而抑制Q基因的翻译 抑制晚期基因的表达 转录产生反义RNA的基因称为反义基因 结合位点 mRNA的SD序列 起始密码子 氨基酸N端的部分密码子结合 二 mRNA本身的二级结构影响翻译的进行 三 蛋白质合成的自体调控 有些蛋白质能够直接控制自身mRNA的可翻译性 核酸结合蛋白或者是与核酸分子相互作用为其生理功能的蛋白质 即 这些蛋白质的mRNA上可能也有其结合位点 1 释放因子RF2合成的自体调控利用自身释放肽链的职能提前终止其mRNA的翻译 当细胞内RF2供应充足时 RF2促成核糖体在上述UGA处肽链合成的终止 若细胞缺乏RF2 则核糖体以未知机制向前滑动一个Nt 发生移框 继续合成到最后一个密码子 RF2蛋白质340个AAcodons不处于同一阅读框 5 GUUCUUAGGGGGUAUCUUUGACUACGAC 3 NH2ValLeuArgGlyTyrLeuAspTyrAspCOOH202122232425262728 2 核糖体蛋白合成的自体调控 E coli核糖体蛋白质的合成与rRNA EF Tu 合成严格协调 数目 通过控制翻译的起点 即控制核糖体与自身mRNA的结合而对其自身蛋白质mRNA可翻译性进行控制 核糖体蛋白质与RNApol各亚基及延伸因子等混合编组在不同的操纵元中 每个operon有一个核糖体蛋白质作为自身operon调节蛋白 每个操纵元的mRNA上具有与调节蛋白的结合位点 靠近或包含SD序列 操纵元mRNA上与调节蛋白的结合位点与组装核糖体时rRNA上结合位点高度同源 具有相似的二级结构 L11 L1opreon 调节蛋白与rRNA的结合力高于与自身mRNA的结合力 调控方式 当细胞内核糖体较少时 有游离的rRNA存在 调控蛋白优先结合rRNA 此时调控蛋白控制的自身操纵元mRNA继续翻译 相反情况 调控蛋白优先结合mRNA 此时调控蛋白控制的自身操纵元mRNA停止翻译 调控实质 核酸的合成水平调节了蛋白质的合成翻译水平调节 五 严谨反应调控 stringentresponsecontrol 基本概念 原核生物在不良的营养条件下 AA饥饿 自动停止或降低 10 20倍 rRNA tRNA转录 从而调节蛋白质合成速度 严谨现象 相关因子 严谨因子 焦磷酸转移酶由relA基因编码正常情况下很少表达 信号分子 魔斑 magicspot ppGpp鸟苷5 3 二磷酸魔斑 magicspot pppGpp鸟苷5 三磷酸3 二磷酸 之所以称为魔斑 AA饥饿时 E coli的薄层层析图谱上有两种Nt与常见的Nt的迁移率不一样 调控机制 空转反应 AA饥饿时 无负载的tRNA进入核糖体的A位后 新肽键不能形成 但GTP不断消耗 空转反应导致信号分子的产生ppGpp