细菌的形态学检查.doc

怀化医专微生物学检验 教案 编号：32009年下学期授课教师李争鸣教研室主任审核签名李争鸣教学课题细菌的形态学检查课时授课时间 月 日 月 日 月 日 月 日9月 7 日 月 日2星期星期星期星期星期五星期授课对象检验 专业班级16目的要求【掌握】1、细菌染色的一般程序。2、革兰染色和抗酸染色的原理、方法、结果、应用。【熟悉】1、显微镜的种类、原理、应用。2、细菌染色常用的染料，常用的细菌染色方法。3、细菌的不染色标本检查法。【了解】细菌的特殊染色方法。教学重点及难点1、细菌染色的一般程序。2、革兰染色和抗酸染色的原理、方法、结果、应用。教法与学法讲解，启发式教学课型理论课教学手段 多媒体教学内容与时间分配1、 显微镜的种类。（20min）2、 不染色标本检查法。（20min）3、 染色标本检查法：常用染料、细菌染色程序、常用的细菌染色法。革兰染色法（35min）抗酸染色法（10 min） 小 结 （10min）复习思考题细菌的形态学检查有何意义？细菌在相同条件下染色，为什么有的染成紫色，有的染成红色？参考资料1、张卓然主编 临床微生物学与微生物检验人卫出版社 第3版 2006.112、倪语星主编 临床微生物学与检验 人卫生出版社 第4版， 2007年3、李凡主编 医学微生物学（本科） 人卫出版社 第7版 2008.1自评本次课做到重点讲解清楚，难点分析透彻，部分内容由于实践性较强，需在实验课上再作详细介绍，如：革兰染色的操作步骤。第八章 细菌形态学检查形态学检查的目的：从形态上识别细菌，为细菌分类与鉴别的基础；了解被检标本中有无细菌；直接从标本中观察到某些细菌，可对少数疾病初步诊断（如结核，脑膜炎等）。第一节 显微镜（microscope）一、普通光学显微镜 原理 自然光的波长为0.4um；显微镜的最大分辨率为0.2um（前者的一半）；肉眼的分辨率为0.2mm，故放大1000倍，使0.2um放大到0.2mm。二、暗视野显微镜 用暗视野聚光器，使反光镜反射过来的光线不能进入镜筒，视野变暗，线从暗视野聚光器周围斜射到菌体上，由于散射作用使菌体发光。常用于活的微生物的动力检测。三、相差显微镜 在检查不染色标本时，由于细菌的折光性与周围环境的折光性相近，对比不明显，看不清细菌及其内部结构，相差显微镜利用相差板的光栅作用，使光波穿过标本中密度不同的部位时，引起位相差，显出光的强度的明暗对比。 应用于活菌的形态及某些内部结构的观察。四、荧光显微镜 以紫外光或蓝紫光作光源，因其波长比自然光短，故分辨率比普通显微镜要高。细菌经过荧光素染色后，在荧光显微镜下，由于菌体各种结构对荧光素的溶解、吸附情况不同，因此发出不同色调和亮度的荧光。五、电子显微镜 以强大的电子流代替光源，因电子流的波长仅为0.005nm，（仅为可见光源的几万分之一），故其放大倍数可达10万-100万倍，可看清1nm的物体。 电镜种类 透射电镜：因电子的透射作用，可观察细菌，virus内部结构，通过荧屏显示。 扫描电镜：因电子流对物体的表面进行扫描，可清楚的显露出物体的三维空间的立体结构，可用于对细菌，virus的表面结构观察。第二节 不染色细菌标本检查法仅用于细菌动力的观察。不能观察细菌的形态和结构特征。 1.压滴法 明视野法、暗视野法。 2.悬滴法 3.毛细管法：孔径0.5-1.0mm，长约60-70mm毛细管，以此管轻取细菌培养物，待液体进入后，两端火焰封融。用于厌氧菌的动力观察。 注意：区别细菌的运动与布朗运动。第三节 细菌染色标本的检查 适于观察细菌的形态和某些结构。一、染料：大多是人工合成的含苯环或苯的有机物。 色 基：即连接在苯环上带双键的有色化学基团，它使染料带颜色，其色基越多，颜色越深。 如-NO2(硝基） -N=N-（偶氮基） 助色基：不显色，它决定了染料与被染物之间的亲和性，且有酸、碱之分，决定了染料的酸碱性： -NH2（碱性） -OH （酸性） 常用染料种类： 1、碱性染料：美兰，结晶紫，碱性复红等，常以氯化物形式存在，色基带正电，易与带负电的被染物结合着色。由于细菌PI低（25），因此常带负电荷，易与该类染料结合。 2、酸性染料：伊红，酸性复红，刚果红，色基带负电。细菌带负电荷不易着色，常用于细胞浆染色，很少用于细菌染色。 3、复合染料（中性染料）：是碱性染料和酸性染料的复合物，可与cell浆结合，如：伊红美兰、伊红天青。 4、单纯染料：多为偶氮化合物，亲和力低，不溶于水，而溶于脂溶剂。常用于脂肪组织染色，如：苏丹染料。二、染色程序：基本步骤： 涂片（干燥）固定染色（初染、煤染、脱色、复染）1、涂片制备：液体标本（细菌培养液）直接涂于玻片上；固体培养基上的培养物 ，取生理盐水涂片，涂成蚕豆大小的菌膜。2、固定： 目的：杀死细菌，使蛋白质凝固，易于着色； 改变其通透性，利于染料进入； 使菌体附着在玻片上； 保持细菌原有的形态、结构。 方法：常用的火焰加热固定法，其它有：冷冻干燥法，化学干燥法。3、染色：（1）初染（2）媒染 目的：加固初染增加染料与被染物的亲和力、使染料固定于被染物、使细胞膜通透性改变。 媒染剂：石炭酸，碘液，明矾，酚等，也可用加热法。（3）脱色 目的：使不该染上颜色的部分脱下颜色。脱色剂：凡能使已经着色的被染物脱去颜色的化学试剂。酸（为碱的脱色剂），碱（为酸的脱色剂），还有甲醇，乙醇等，无机酸脱色能力强于有机酸，醇类中分子量小的强于分子量大的。脱色机制：有的起溶媒作用（如醇类），有的影响蛋白质的电离程度，改变其电荷的性质或数量，从而影响细菌与染料结合的程度（如酸碱）。（4）复染（对比染色）常用染料：稀释复红、沙黄（与紫色对比）、美兰、苦味液（与红色对比） 三、常用的染色法（一）单染法： 用一种染料染，细菌及周围部分都染成同一种颜色主要用于观察细菌的形态、大小、排列及简单的结构，如美兰染色，复红染色。（二）复染法： 用两种以上的染料，将不同的细菌或同一细菌的不同结构染成不同的颜色。可用于细菌的鉴别。常用的有1. 革兰染色法（Gram stain):由丹麦细菌学家Christain Gram首创，已有100多年的历史。染料： 结晶紫、卢戈氏碘液、95%酒精、稀释石炭酸复红。原理： （1）等电点学说：革兰阳性菌ph2-3,低于革兰阴性菌ph4-5。与带正电荷的染料结合牢固。 （2）化学学说：革兰阳性菌含大量核糖核酸镁盐，与结晶紫和碘结合成大分子复合物而不易被脱色。 （3）通透性学说：革兰阳性菌cell wall因肽聚糖厚，脂类少， 通透性低，酒精不易进入脱色，相反革兰阴性菌肽聚糖少，含脂多，易被酒精溶解，使cell wall通透性升高。方法：略（实验课介绍）结果：G+菌：紫色；G-菌：红色意义：（1）鉴别细菌；（2）选择药物参考；（3）与致病性有关。2. 抗酸染色（acid-fast stain）原理：分枝杆菌一般不易着色，若用5%石炭酸复红加温并延长染色时间，可染上红色，又因其菌体中含有分枝菌酸，可抵抗3%盐酸酒精的脱色，仍保持红色，故称为抗酸菌。方法：涂片、干燥、固定 石炭酸复红（初染）加热至冒蒸汽5min 盐酸酒精脱色 碱性美兰（复染）1min结果、意义：3、特殊染色法（1）细胞壁染色： 染液：10鞣酸溶液、0.5结晶紫溶液 方法：涂片自然干燥鞣酸染15min，水洗结晶紫染35min，水洗待干，镜检。 结果：细胞壁（