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白花丹中白花丹素-铜与牛血清蛋白作用研究综述1.简介：蛋白质是人体及体内一切细胞的基本构成物质，是物质性状的直接表达者。血清蛋白最显著的特征就是：作为内源和外源性物质的储存和运输性蛋白，而外源性物质中能与血清蛋白紧密结合的物质就是有机小分子。研究蛋白质与配体分子之间的作用机理和作用过程，了解在小分子物质作用下蛋白质结构和功能的变化，是目前生命科学、化学和医学界共同关注的课题。牛血清蛋白（BSA）与人血清蛋白（HSA）具有相似的序列和构象，因此BSA成为研究药物与蛋白相互作用的最佳底物。通过光谱法研究小分子配合物与BSA作用的生物活性、药物活性和化学活性具有重要意义。白花丹为自然界的植物，为多民族药材，在民间应用广泛。近年来，随着生命科学、配位化学、生物无机化学和天然药物化学之间的交叉作用，对天然药物有效成分的金属配合物研究受到关注。低毒、高效的金属配合物为小有机分子，研究蛋白质与这种有机小分子金属配合物的作用机理将有重大意义。删 荧光和紫外可见光谱全文分别归纳紫外光谱、荧光光谱和园二色谱法或红外光谱法 的研究研究方法与特点。法是研究生物大分子,特别是蛋白质与各种有机小分子、离子和无机化合物相互作用的重要手段。通过对荧光特征峰及其在不同条件下的位移情况、荧光偏振、同步荧光、能量转移效率、荧光寿命、荧光猝灭、荧光增强等的研究,可以获得蛋白质分子中荧光生色基团的种类、结构和所处微环境及其分布情况等有用信息,同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据。2.方法与结果：2.1 蔡青青、聂伟1等采用红外光谱法分析铅与牛血清蛋白的作用，此试验使用Nicolet FTIR 170XkBr压片，扫描范围是5004 000em，对各个反应体系进行红外检测。从红外光谱图的分析，得出Pb 对就牛血清蛋白的光谱性质有重要影响，铅能使BSA的羟基位置产生红移现象，蛋白质上的O-H，一CH，-CH：都有可能是铅的作用位置，即铅与牛血清蛋白能发生络合反应，产生多种大分子络合物。2.2 杨昌英、刘义2等用光谱法研究了吲哚美辛、舒林酸及其金属配合物与牛血清蛋白的相互作用。他们以曙红Y(Eosin Y)为探针,采用竞争结合法考查了非甾体抗炎药吲哚美辛和舒林酸及其相关的金属配合物与BSA的结合。在中性环境中,曙红Y的吸收光谱随着BSA的加入发生明显变化,结果表明,曙红Y与BSA之间的结合以静电作用为主,两者之间可能发生电子转移。曙红Y与BSA结合后,抗炎药吲哚美辛,舒林酸的加入可以破坏这种结合,曙红Y部分游离出来,其吸收值恢复,说明药物可以同样的方式结合到BSA上,抢占曙红Y在BSA上的结合位点。将药物转化为金属配合物后,与血清蛋白的亲和程度更强,铜()的配合物最为突出,推测将非甾体抗炎药转化为铜配合物后,有更好的药理活性。 2.3 黎泓波、王兴明3采用UV-Vis光谱法研究了pH=428的缓冲溶液中茜素红S(ARS)-Al()配合物与牛血清蛋白(BSA)的结合反应. 用pH428的B-R缓冲溶液配制一定物质的量浓度BSA、ARS和Al()溶液;在一系列10 mL比色管中,分别加入一定量的上述BSA、ARS和Al()溶液,以pH428的B-R缓冲溶液定容,摇匀,放置4 h,以B-R缓冲溶液为参比,扫描吸收光谱;应用平衡透析物质的量比法、普通物质的量比法和双波长法等方法,以相应B-R缓冲溶液为参比,扫描吸收光谱或测定吸光度. 研究发现,ARS-Al()-BSA的最大吸收波长为510 nm,比ARS红移82 nm,比ARS-BSA红移75 nm,比ARS-Al()配合物红移74 nm.ARS-Al()-BSA三元配合物的结合比为nARSnAl()nBSA=641,物质的量吸光系数为265104Lmol-1cm-1,ARS-Al()配合物与BSA作用的条件平衡常数K为880108Lmol-1.ARS-Al()配合物与BSA之间的作用力主要为配位键和电荷力.2.4 肖厚荣,盛良全4等应用荧光光谱研究了水杨酸与牛血清蛋白(BSA)分子间的相互作用。移取2 mL 8010-6molL-1的BSA于1 cm石英比色池中,用微量注射器(范围: 15L)或可调式移液管逐次加入2, 4, 8, 16, 24, 32, 72L的水杨酸溶液进行荧光滴定,每次加入溶液后混合均匀,在30下作用10 min,以282 nm为激发波长,在M-850型荧光分光光度计上记录300500 nm波长范围内的发射光谱。研究表明:水杨酸对BSA内源荧光的猝灭机制属于形成化合物所引起的静态猝灭,猝灭常数Ksv为1097104(molL-1)-1;水杨酸与BSA反应的结合常数为7377104,结合位点数为1,当水杨酸浓度较低(摩尔比小于1：1)时,它与Trp残基或其附近基团结合但并不引起Trp残基微环境的改变;根据F rster非辐射能量转移理论,计算了授体-受体间的结合距离和能量转移效率。2.5 罗红斌、张静5等应用荧光光谱研究了岩白菜素与牛血清白蛋白(BSA)分子间的相互作用。移取2 mL 2. 510-6molL-1的BSA于1 cm石英比色池中,用可调式移液器逐次加入2, 4, 8, 10, 16,20, 100L的岩白菜素溶液进行荧光滴定,每次加入溶液后混合均匀,在30下作用10 min,以292 nm为激发波长,在M2850型荧光分光光度计上记录300500 nm波长范围内的发射光谱。结果表明,岩白菜素对BSA内源荧光的猝灭机制属于形成化合物所引起的静态猝灭,猝灭常数Ksv为1. 905104Lmol-1;岩白菜素与BSA反应的结合常数为2. 083104,结合位点数为1.由热力学参数确定了岩白菜素与牛血清白蛋白的结合作用主要为静电作用.实验还发现随着岩白菜素的加入,BSA的猝灭值与岩白菜素浓度在1. 510-51. 510-4molL-1的范围内呈良好的线性关系,检出限2. 010-6molL-1,可用于岩白菜素的测定。2.6 杜娜娜、张坤等用紫外吸收光谱和荧光光谱研究了异烟肼(INH)与牛血清蛋白(BSA)的相互作用。2.6.1 紫外吸收光谱的测定 取2只1 cm的比色皿,样品池中加入1mL 110-5molL-1BSA和1mL 0. 1molL-1pH=8. 0的缓冲液,参比池中加入1mL二次蒸馏水和1mL 0. 1molL-1pH=8. 0的缓冲液,然后向2只比色皿中依次用微量注射器加入不同量的INH并搅匀,5min后记录室温下BSA在190330 nm的紫外吸收光谱.取2只1cm的比色皿,样品池中加入3. 5 mL 0. 065 mgmL-1的BSA溶液(相应的缓冲溶液配制),参比池中加入3. 5mL不同酸度的缓冲溶液作空白,然后在2只比色皿中分别用微量注射器加入10L0. 48 mgmL-1的INH并搅匀,自样品池中加入INH开始计时,于230 nm进行动力学扫描,获得相互作用的动力学曲线.2.6.2 荧光光谱的测定 取一只1 cm的比色皿,加入0. 2mL BSA储备液及2. 0mL pH=8. 0的缓冲液,用微量注射器依次加入不同量的INH储备液并搅匀,测量时选择的激发波长和发射波长分别为280 nm和340 nm,激发和发射狭缝均为10 nm.相互作用5min,测量25、30下BSA的荧光光谱.2.6.3 INH与BSA的同步荧光测定 用2. 6. 2同样的25的测试体系,固定激发和发射波长间隔分别为20 nm和60 nm,相互作用5min,记录同步荧光光谱.荧光光谱表明, INH对BSA的荧光有较强的猝灭作用.通过结合常数和结合位点数的计算,证明这种荧光猝灭机理符合静态机制, INH和BSA形成了11稳定复合物;考察不同温度和酸度下的猝灭作用,进一步证实其静态猝灭行为和疏水作用机制.紫外吸收光谱和同步荧光光谱表明, INH与BSA的相互作用使蛋白质的分子构象发生变化,而同步荧光光谱显示两者的结合位点更接近于色氨酸.2.7 玄光善、吴效楠7等应用荧光光谱法研究了乙酰水杨酸和牛血清蛋白(BSA)分子间的相互作用。在10mL容量瓶中,依次加入1g/L的BSA溶液0.8mL和不同量的10-3mol/L乙酰水杨酸溶液,随后加入5mL醋酸缓冲溶液并用蒸馏水稀释到刻度。以285nm为激发波长,记录在300450nm波长范围的发射光谱。 研究表明乙酰水杨酸可猝灭BSA的荧光,同时自身的荧光增强并存在一个等发射点,表明两者之间形成稳定的复合物并发生能量转移。乙酰水杨酸和BSA分子间的结合常数为1.35103,结合数0.87,静电引力是结合反应的主要的作用力。同时观察了乙酰水杨酸的加入对BSA构象的影响。对于蛋白质的同步荧光光谱,=15nm时只显示酪氨酸残基的光谱特性,而由=60nm时仅表现色氨酸残基的光谱特性。因为残基的最大吸收波长与其所处的环境有关,因此由发射波长的改变可判断蛋白质构想的变化。BSA和乙酰水杨酸的混合溶液的同步荧光光谱表明仅有BSA酪氨酸的残基的荧光强度降低而没有发射波长的位移,对=60nm时也有类似的情况。说明乙酰水杨酸的加入对BSA的构象几乎没有改变。2.8 陈克海、王玉莲8等用紫外、荧光和圆二色光谱研究了不同温度下长春新碱(VCR)与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用。281 荧光光谱的测定取25 mL 5lO-6 rno卜L-1的BSA溶液(用O05 molL_1 Tris_Ha缓冲液配制，内含o1 Ino卜L-1 Nacl，pH740)加入到光径为10 mm的石英比色池中，依次加入一定体积的VCR溶液进行荧光滴定(总体积小于80正，)，轻轻摇匀，296 K时静置3 IIlin。以280 nnl为激发波长，选择合适的狭缝宽度，在荧光分光光度计上记录285450啪波长范围的荧光发射光谱。303和310 K按同样的方法处理。282 圆二色光谱(CD)的测定移取300肛L 510一6 m01L_1 BsA溶液到光径为1mm的圆形比色池中，用微量进样器加入适量的vCR溶液，296K静置作用3 mh，在CD上测定200260 m范围内的圆二色谱。扫描速度为20衄min，响应时间为4 s。通过荧光猝灭数据算得在296，303和310 K时，vcR与BSA的猝灭常数K分别为2o104，17104和15104 LInol-1，结合常数K。分别为15104，95103和49103 Lmol-1，结合位点数分别为o978 6，0949 O和O891 1，表明VCR与BSA间具有较强的结合作用，但结合能随着温度的升高而降低，是形成复合物的静态猝灭。圆二色光谱(CD)数据表明相互作用后BsA的二级结构发生了改变：BSA的口-螺旋的含量从335下降到297，p折叠的含量从136升高到184。通过Vant Hoff方程，计算出热力学常数焓变(H)和熵变(S)分别为：一627kJmol-1和一12938 J(rnorlK)一，表明氢键和范德华力在VCR与BSA结合中处于主导作用。2.9 王兴明、 董发勤9等研究了锌试剂一Cu(11)金属配合物与牛血清蛋白作用。在一系列10 mL比色管中，分别加入一定量的ZCN、Cu(1)、BSA溶液(3种溶液均分别用系列BR缓冲溶液配制)，以相应BR缓冲溶液定容，摇匀，放置5 min，以水为参比，测定其吸收光谱。在一系列10 mL比色管中，分别加入一定的量ZCN、Cu(1)、BSA溶液(3种溶液均用pH 425的BR缓冲溶液配制)，以pH 425的BR缓冲溶液定容，摇匀，放置5 rain，应用摩尔比法、双波长法等，以水或试剂空白为参比，测定其吸收光谱或吸光度。综上所述，ZCNCu(1)金属配合物与BSA在pH425的缓冲溶液中以分子间静电引力为主、分子间疏水力为辅结合形成三元蓝色缔合物，最大吸收峰发生了明显的红移。同时，电子转移配合物的形成，也是ZCNCu()一BSA三元缔合物的吸收峰较明显红移的重要原因。根据结合数和条件结合常数的测定结果，可推测ZCNCu(1)金属配合物在BSA分子中的作用位点。认为5个ZCNCu(1)金属配离子(每个带2个单位的负电荷)可与2个BSA分子结合，即每个ZCNCu(1)金属配离子与2分子蛋白质结合。每个蛋白质分子的作用位点为5个部位，一是BSA分子中的质子化而带正电荷的精氨酸的胍基、脯氨酸的吡咯基和组氨酸的咪唑基，二是BSA分子中水溶性较差的氨基被质子化的酪氨酸和胱氨酸分别与ZCNCu(1)金属配离子中的苯基以疏水力靠近，并导致两者静电引力的产生和增强(发色基团基本无变化)。摩尔比法和双波长法测定的结果基本一致，该研究结果对于进一步探索BSA的性能、构象及其定量测定具有重要参考价值。3、参考文献1 蔡青青h，聂伟 ，梁莹h，董铁有 铅与牛血清蛋白的相互作用及模拟透析性能 1河南科技大学a化工与制药学院；b环境工程研究所，河南洛阳471003；2郑州大学公共卫生学院，河南郑州4500012 杨昌英刘义朱军成刘松秀 光谱法研究吲哚美辛,舒林酸及其金属配合物与牛血清蛋白的相互作用 1（三峡大学化学与生命科学学院,宜昌443002)2(武汉大学化学与分子科学学院,武汉430072)3 黎泓波1,王兴明1,刘海萍1,董发勤1,康明1,丁立生2 茜素红S-Al()配合物与牛血清蛋白的相互作用 (1.西南科技大学化学系,