酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究.doc

酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究袁某某（西北农林科技大学 陕西杨凌）摘要采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，即在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎再通过乙醇的分级与透析，得到纯化的酵母蔗糖酶。本实验也通过考马斯亮蓝G250染色法，测定蔗糖酶的活力和蛋白质浓度，对蔗糖酶的性质进行了研究。关键词蔗糖酶，分离提取，酶活力，蛋白质含量1 引言自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。2 材料与方法2.1 实验材料高活性干酵母粉、DEAE纤维束DE-23、0.2mol/L Tris-HCL缓冲液、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、葡萄糖、水杨酸、0.4mol/L NaOH溶液2.2 实验方法2.2.1 蔗糖酶的提取与部分纯化 将15g高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀，再于35恒温水浴中搅拌30min。抽提补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35恒温过夜，8000r/min离心10min，弃沉淀及脂层，的粗级分。预先将恒温水浴调到50，将盛有粗体级分的离心管稳妥地放入水浴中，不断轻摇离心管保存30min。取出离心管，于并于中迅速冷却，4，10000r/min, 离心10min。取上清液，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为热级分）。将热级分转入小烧杯中，放入冰盐浴，逐滴加入等体积预冷至-20的95%乙醇，同时轻轻搅拌30min，再冰盐浴10min，以沉淀完全。4，10000r/min, 离心10min，弃去上清液，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子，然后将其放入冰箱中冷冻保存，即醇级分。2.2.2 酶活性及酶活力影响因素的研究 采用水杨酸试剂显色法，通过测定反应后样品中还原糖的量来确定酶活力。（1） 标准曲线的制作 取做好编号的试管，按下表进行实验。管号01234567891020mmol/L葡萄糖/ml0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0葡萄糖/mol02468101214161820/ml1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0水杨酸试剂/ml22222222222沸水浴5min，流水冷却，定容至15ml00.1020.1610.2150.2620.3330.3530.3850.4120.4400.479(2) 反应时间的影响 取做好编号的试管，按下表进行实验。管号123456789100.2mol/L蔗糖/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2乙酸缓冲液pH5.0/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.60.4mol/L NaOH/ml1.0由加酶开始计时蔗糖酶/ml0.40.40.40.40.40.40.40.40.4反应时间/min0136101520304050反应时间到后立即向210管加入1ml 0.4mol/L NaOH终止反应。并向各管加入2ml 3,5-二硝基水杨酸，沸水浴准确煮5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0.1160.1870.3140.3940.3230.7170.8321.0041.3290.016生成还原糖mol/ml0.1620.3730.7510.9890.7781.9502.2922.8033.770（3） pH值的影响 取做好编号的试管，按下表进行实验。管号123456780.2mol/L蔗糖/ml0.20.20.20.20.20.20.20.2乙酸缓冲液pH3.54.04.55.05.56.0pH梯度/ml0.20.20.20.20.20.2/ml0.80.20.4mol/L NaOH/ml1.0蔗糖酶/ml0.60.60.60.60.60.60.660准确反应10min0.4mol/L NaOH/ml1.01.01.01.01.01.01.0水杨酸试剂/ml2.02.02.02.02.02.02.02.0沸水浴5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0.0211.0331.0221.0691.3031.2621.2140.837生成还原糖mol/ml2.8902.8572.9973.6933.5713.4282.307（4） 温度的影响 取做好编号的试管，按下表进行实验。管号123456789100.2mol/L蔗糖/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2乙酸缓冲液pH5.0/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2/ml0.60.60.60.60.6蔗糖酶/ml0.60.60.60.60.6温度/40405050606070708080反应时间/min0136101520304050各温度反应10min后，每管加入1ml 0.4mol/L NaOH终止反应。并向各管加入2ml 3,5-二硝基水杨酸，沸水浴准确煮5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0.963-0.0170.702-0.0201.194-0.0150.536-0.0030.542-0.013生成还原糖mol/ml2.68141.9053.3681.4111.429（5） 底物浓度的影响 取做好编号的试管，按下表进行实验。管号123456780.5mol/L蔗糖/l02030406080100200/l600580570560540520500400乙酸缓冲液pH5.0/l200200200200200200200200蔗糖酶/ml20020020020020020020020060准确反应10min0.4mol/L NaOH/ml1.01.01.01.01.01.01.01.0水杨酸试剂/ml2.02.02.02.02.02.02.02.0沸水浴5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0.0500.1690.2040.2690.3540.3720.3900.545生成还原糖mol/ml0.3200.4240.6170.8700.9240.9771.438（6） 脲对蔗糖酶的抑制作用 取做好编号的试管，按下表进行实验。管号123456789100.5mol/L蔗糖/l0000202020203030蔗糖酶/l200200200200200200200200200200乙酸缓冲液pH5.0/l2002002002002002002002002002004mol/L脲/l010020030001002003000100/l60050040030058048038028057047060准确反应10min0.4mol/L NaOH/ml1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0水杨酸试剂/ml2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0沸水浴5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0.0460.0600.0550.0540.3160.3140.2650.1820.3870.306生成还原糖mol/ml0.7570.7510.6050.3580.9680.727管号1112131415161718192021220.5mol/L蔗糖/l303040404040606060608080蔗糖酶/l200200200200200200200200200200200200乙酸缓冲液pH5.0/l2002002002002002002002002002002002004mol/L脲/l200200010020030001002003000100/l37027056046036026054044034024052042060准确反应10min0.4mol/L NaOH/ml1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0水杨酸试剂/ml2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0沸水浴5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0.2280.2050.4600.3760.3610.3020.6640.5620.4680.4331.0880.916生成还原糖mol/ml0.4950.4271.1850.9350.8920.7151.7921.4891.2091.1053.0532.542管号232425262728293031320.5mol/L蔗糖/l8080100100100100200200200200蔗糖酶/l200200200200200200200200200200乙酸缓冲液pH5.0/l2002002002002002002002002002004mol/L脲/l20030001002003000100200300/l32022050040030020040030020010060准确反应10min0.4mol/L NaOH/ml1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0水杨酸试剂/ml2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0沸水浴5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0.6880.4951.0670.8910.6850.6021.0290.9800.7370.676生成还原糖mol/ml1.8631.2892.9912.4671.8551.6082.8782.7322.0091.8282.2.3离子交换柱层析纯化蔗糖酶（1）以DEAE纤维素DE-23为吸附剂，处理好后加少量水边搅拌边倒入层析管中，缓慢沉降，并以100ml 0.02mol/LpH7.0Tis-HCL缓冲液过柱，调整流速为5ml/2min。平衡后，采用100ml 0.02mol/LpH7.0Tis-HCL缓冲液和100ml（含0.2ml/LNaCL）0.02mol/LpH7.0Tis-HCL缓冲液，进行线性梯度洗脱。（2）用3ml缓冲液醇级分，留取1ml用于测酶活力及蛋白含量。剩余的4000r/min离心1min，除去不溶物，取上清液小心地加到层析柱上（上样前在柱床表面加一张同一大小的柠檬纸）。开始洗脱后，连续收集洗脱液，每试管收集10ml。每试管分别取0.6ml洗脱液，置于不同的试管中，分别加入0.2ml 0.2mol/L蔗糖，0.2ml 0.2mol/L pH为5.0的乙酸缓冲液及2ml水杨酸，沸水浴5min后观察各试管中溶液颜色，将颜色最深的四个试管对应的洗脱液试管中的溶液合并。（3）将合并的洗脱液浓缩后取1ml用于测酶活力及蛋白含量（柱级分），剩余的使用PEG2000透析浓缩液用于进一步离子交换柱层析纯化。按步骤（1）（2）重复实验（注意上样之后立即收集洗脱液），得柱级分。2.2.4蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定各级分蛋白质含量的测定（1） 标准曲线的制作取做好编号的试管，按下表进行实验。管号012345678910牛血清蛋白/ml0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0牛血清蛋白/g0.020406080100120140160180200/ml1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0考马斯亮蓝G-250/ml555555555550.000.1110.2640.3400.5260.7080.8600.9601.1461.2081.297（2） 各级分蛋白质含量的测定各级分按以下稀释倍数稀释：粗级分-5倍；热级分-5倍；醇级分-10倍；柱级分-10倍。 取做好编号的试管，按下表进行实验。管号0级分级分级分级分12345678酶液/ml011111111/ml100000000加入考马斯亮蓝G-250各5m，混匀后静置2min后在595nm测吸光度1.2041.2000.8630.8530.4170.3210.1420.147平均值1.2.20.8580.3690.1445蛋白质浓度g/ml29.74621.0029.1913.768酶活力的测定 采用水杨酸试剂显色法，通过测定反应后样品中还原糖的量来确定酶活力。（1）标准曲线的制作管号01234567891020mmol/葡萄糖/ml0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0葡萄糖/mol02468101214161820/ml1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0水杨酸试剂/ml22222222222沸水浴5min，流水冷却，定容至15ml00.1020.1610.2150.2620.3330.3530.3850.4120.4400.479（2） 各级分酶活力大小的测定取做好编号的试管，按下表进行实验。管号对照级分级分级分级分级分123456789101112酶液/ml0.00.60.60.60.60.60.60.60.60.60.6/ml0.6乙酸缓冲液pH5.0/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.4mol/L NaOH/ml10.2mol/L蔗糖/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温反应10min，反应后向312试管中加入NaOH终止反应水杨酸试剂/ml2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0沸水浴5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0.7200.6810.5560.6250.2400.2230.1270.1500.1380.135生成还原糖mol/ml1.9581.8431.4711.6760.5310.4800.1950.2630.2280.2192.2.5 分离产物的SDS-PAGE电泳检测分离胶（ml）浓缩胶（ml）H2O8.27.35Acr-Bis6.681.3分离胶缓冲液pH8.85.0浓缩胶缓冲液pH6.81.2510%SDS0.10.110%APS0.070.06TEMED（最后加）0.040.1将玻璃板洗净、晾干、固定。按照实验要求，配制12%的分离胶，迅速注入玻璃板夹层中，上部用乙醇封面，保持胶面平整。待分离胶聚合后，配制5%的浓缩胶，倒去分离胶表面的乙醇，然后灌入浓缩胶，插入点样梳。拔出样品梳后加入缓冲液，点样取10l标准蛋白溶解液于EP管内，加入10l2倍样品缓冲液，上样量为20l；取10l样品（五个级分），再加入10l2倍样品缓冲液，上样量为20l。接通电源进行电泳。电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。加入染色液，染色过夜。将染好色的凝胶板直接放入脱色液中脱色，并拍照。3 数据分析与结果3.1 吸光度对葡萄糖浓度做标准曲线：3.1.1 反应时间对产物浓度的影响分析由图可知，在一定范围内反应时间越长，产物浓度越高。反应初速度V（还原糖）=0.3305mol/ml3.1.3 pH值对酶促反应影响分析 由图可计算出当pH值为3.6477时，生成还原糖量最多，即酵母蔗糖酶最适反应pH值为3.64777.3.1.4 温度对酶促反应影响分析由图可计算出，当温度为49时，生成还原糖量最多，即酵母蔗糖酶最适反应温度为49。3.1.5 底物浓度对酶促反应的影响分析由图可计算出=2.733.1.6 脲对蔗糖酶酶促反应的影响分析当脲素浓度为0时1/Vmax=1.1083 Km/ Vmax =8.5677故Km=7.911 Vmax=0.902当脲素浓度为26.67（umol/ml）时1/Vmax=-1.399 Km/ Vmax =15.494故Km=-11.075 Vmax=-0.715当脲素浓度为53.33（umol/ml）时1/Vmax=-3.4956 Km/ Vmax =22.474故Km=-6.429 Vmax=-0.286当脲素浓度为80（umol/ml）时1/Vmax=1.046 Km/ Vmax=18.78