PI3KAKT通路芯片检测方法.doc

AKT/PKB信号通路蛋白质磷酸化检测抗体芯片（PAB216）产品介绍 Ser/Thr蛋白激酶AKT（v-Akt Murine Thymoma Viral Oncogene）又名PKB (Protein Kinase-B)，在细胞因子、生长因子、荷尔蒙及分裂素等胞外信号分子与RTKs（Receptor Tyrosine Kinase）结合引起的下游信号转导过程中起着核心作用。AKT/PKB信号通路激活主要引起抗凋亡和促细胞增殖效应，进而在转录因子调节、蛋白合成、细胞周期、凋亡与代谢中发挥关键作用。AKT/PKB信号通路与NF-B、ERK、JNK、Apoptosis等信号通路密切相关，在2型糖尿病、肿瘤等疾病的病理发展中的作用日益明确。AKT/PKB通路蛋白质磷酸化检测抗体芯片（PAB216） ，采用三维高分子膜专利技术，在片基上共价结合216种高特异抗体，并运用特有的荧光标记技术进行样本标记，以实现对AKT/PKB经典信号通路的高覆盖检测。芯片提供信号蛋白多个关键磷酸化位点的同步检测，针对每一个特定蛋白磷酸化位点，设置一对抗体分别检测其磷酸化（Phospho）和非磷酸化（non-Phospho）状态。同时，芯片可检测多种已有文献报道的非AKT/PKB经典通路的信号蛋白，极大扩展AKT/PKB单一信号通路研究的延伸性。 检测特点： 1. 芯片规格为76 x 25 x 1 mm；2. 实现单一信号通路全面筛选；3. 每种抗体设置6次技术重复；4. 适用于组织、细胞等多类型样本；5. 5106细胞、200 g总蛋白量即可满足实验；6. 每个检测位点设有磷酸化和非磷酸化配对抗体；7. 可通用于人、小鼠、大鼠等多类型模式生物检测。检测原理：检测列表： 14-3-3 theta/tau (Ser232) 14-3-3 (Ser58) 14-3-3 / (Thr232) PFKFB2 (Ser483) AKT (Ser473) AKT (Thr308) AKT (Tyr326) AKT1 (Ser124) AKT1 (Ser246) AKT1 (Thr450) AKT1 (Thr72) AKT1 (Tyr474) AKT1S1 (Thr246) AKT2 (Ser474) BAD (Ser112) BAD (Ser134) BAD (Ser136) BAD (Ser155) BAD (Ser91/128) BCL-2 (Ser70) BCL-2 (Ser87) BCL-2 (Thr56) BCL-2 (Thr69) BIM (Ser69/65) Cyclin D1 (Thr286) eNOS (Ser1177) eNOS (Ser615) eNOS (Thr495) FAK (Ser910) FAK (Tyr397) FAK (Tyr407) FAK (Tyr576) FAK (Tyr861) FAK (Tyr925) FKHR (Ser256) FKHR (Ser319) FOXO1/3/4-PAN (Thr24/32) FOXO1A (Ser329) FOXO1A/3A (Ser322/325) Gab1 (Tyr627) Gab1 (Tyr659) Gab2 (Tyr643) GABA-RB (Ser434) GSK3a-b (Tyr216/279) GSK3 (Ser21) GSK3 (Ser9) IKK (Thr23) IKKa/b (Ser180/181) IRS-1 (Ser1101) IRS-1 (Ser307) IRS-1 (Ser312) IRS-1 (Ser323) IRS-1 (Ser612) IRS-1 (Ser636) IRS-1 (Ser639) IRS-1 (Ser794) JAK1 (Tyr1022) LYN (Tyr507) MDM2 (Ser166) mTOR (Ser2448) mTOR (Ser2481) mTOR (Thr2446) p21Cip1 (Thr145) p27Kip1 (Ser10) p27Kip1 (Thr187) p53 (Ser15) p53 (Ser20) p53 (Ser315) p53 (Ser33) p53 (Ser366) p53 (Ser37) p53 (Ser378) p53 (Ser392) p53 (Ser46) p53 (Ser6) p53 (Ser9) p53 (Thr18) p53 (Thr81) p70S6K (Ser371) p70S6K (Ser411) p70S6K (Ser418) p70S6K (Ser424) p70S6K (Thr229) p70S6K (Thr389) p70S6K (Thr421) p70S6K- (Ser423) Paxillin (Tyr118) Paxillin (Tyr31) PDK1 (Ser241) PI3K (Tyr607) PI3K / (Tyr467/Tyr199) PIP5K (Ser307) PP2A-a (Tyr307) PTEN (Ser370) PTEN (Ser380) PTEN (Ser380/Thr382/Thr383) RapGEF1 (Tyr504) RPS6(Ser235) SYK (Tyr323) SYK (Tyr348) SYK (Tyr525) SYN1-Synapsin1 (Ser62) Tuberin/TSC2 (Ser939) Tuberin/TSC2 (Thr1462) WEE1 (Ser642) XIAP (Ser87) 相关文献：1. Jia D, et al.Amplification of MPZL1/PZR promotes tumor cell migration through Src-mediated phosphorylation of cortactin in hepatocellular carcinoma.Cell Res, 2014, (24):204-217. (上海仁济医院)2. Ding Y, et al.Seed-targeting anti-miR-21 inhibiting malignant progression of retinoblastoma and analysis of their phosphorylation signaling pathways.Exp Eye Res,2014. (暨南大学) 3. Dong S, et al.The REG Proteasome Regulates Hepatic Lipid Metabolism through Inhibition of Autophagy.Cell Metab, 2013, 18(3): 380-391.（华东师范大学） 4. Li L et al.REG deficiency promotes premature aging via the casein kinase 1 pathway.Proc Natl Acad Sci USA.2013; June 13.（华东师范大学） 5. JinL et al. p90 RSK2 Mediates Antianoikis Signals by both Transcription-Dependent and -Independent Mechanisms.Mo Cell Biology.2013; 33(13): 2574-2585. 6. Iwata J et al. Noncanonical Transforming Growth Factor (TGF) Signaling in Cranial Neural Crest Cells Causes Tongue Muscle Developmental Defects.J. Biol Chem. 2013; 288: 29760-29770. 7. Izzotti A et al. Relationships between pulmonary microRNA and proteome profiles, systemic cytogenetic damage, and lung tumors in cigarette smoke-exposed mice treated with chemopreventive agents.Carcinogenesis.2013; May 24. 8. Xu N et al.Activation of RAW264.7 mouse macrophage cells in vitro through treatment with recombinant ricin toxin-binding subunit B: Involvement of protein tyrosine, NF-B and JAK-STAT kinase signaling pathways.Int J Mol Med. 2013; 32(3): 729-735. （吉林大学） 9. Li F et al. Superoxide Mediates Direct Current Electric Field-Induced Directional Migration of Glioma Cells through the Activation of AKT and ERK.PLoS ONE.2013; 8(4): e61195. （第三军医大学） 10. Cui WY et al. Identification and Characterization of Poly(I:C)-induced Molecular Responses Attenuated by Nicotine in Mouse Macrophages.Mol Pharmacol.2013; 83:61-72. （浙江大学） 11. Shin D. M., et al. Chemoprevention of head and neck cancer by simultaneous blocking of epidermal growth factor receptor and cyclooxygenase-2 signaling pathways: preclinical and clinical studies.Clin Cancer Res. 2013; 19(5): 1244-1256. 12. Eke I et al. EGFR/JIP-4/JNK2 signaling attenuates Cetuximab-mediated radiosensitization of squamous cell carcinoma cells.Cancer Research. 2013; 73(1):297-306. 13. Fan H et al. Cardioprotective Effects of Salvianolic Acid A on Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury In Vivo and In Vitro.Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 508938. （烟台大学） 14. Zhang YM et al. A novel angiogenesis inhibitor impairs lovo cell survival via targeting against human VEGFR and its signaling pathway of phosphorylation.Cell Death Dis. 2012; 3: e406. （西安交通大学） 15. Sacc SC et al. New proteins as vascular biomarkers in primary open angle glaucomatous aqueous humor.Invest Ophthalmol Vis Sci.2012; 28, 53(7):4242-53. 16. Makishima H et al.CBL mutation-related patterns of phosphorylation and sensitivity to tyrosine kinase inhibitors.Leukemia. 2012; 26(7):1547-54. 17. Bernier M et al. Negative regulation of STAT3 protein-mediated cellular respiration by SIRT1 protein.J Biol Chem.2011; 286(22): 19270-19279. 18. Yu Y et al. Cellular Iron Depletion Stimulates the JNK and p38 MAPK Signaling Transduction Pathways, Dissociation of ASK1-Thioredoxin, and Activation of ASK1.J Biol Chem, 2011; 286: 15413-15427. 19. Hu Y, Pioli P D, Siegel E, et al. EFEMP1 suppresses malignant glioma growth and exerts its action within the tumor extracellular compartment.Mol Cancer, 2011, 10: 123. 20. Li Hui et al. Increased prevalence of regulatory T cells in the lung cancer microenvironment: a role of thymic stromal lymphopoietin.Cancer Immunology Immunotherapy. 2011; 60(11): 1587-1596. （天津医科大学） 21. Izzotti A et al.Proteome Alterations in Primary Open Angle Glaucoma Aqueous Humor.J Proteome Res. 2010; 9 (9): 4831-4838. 22. Kang S et al. p90 ribosomal S6 kinase 2 promotes invasion and metastasis of human head and neck squamous cell carcinoma.J Clin InvestPI3K/Akt/mTOR信号通路关键词： 信号通路 抑制剂 细胞 2012-07-17 00:00 来源：互联网 点击次数：3767 目的：通过特异性阻断PI3K和mTOR，观察HepG2和Hep3B细胞株PI3K/Akt/mTOR信号通路活性及生物学行为的改变，探讨相关的分子机制。 方法：在培养的HepG2、Hep3B人肝癌细胞株和人正常肝细胞株QSG-7701上，以免疫印迹方法（Western blot）检测各细胞株中PI3K（p110亚单位）、PTEN、pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表达情况；分别用 PI3K抑制剂LY294002（50mol/ml）和mTOR抑制剂Rapamycin（RAPA，50 nmol/ml）孵育HepG2和Hep3B细胞，以MTT比色法检测细胞的增殖能力，以流式细胞术（Flow cytometry）检测细胞周期和凋亡情况，以Western blot法检测细胞中pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表达改变。 结果：PTEN在HepG2和Hep3B细胞中基本无表达，在QSG-7701细胞株中高表达，pAkt和p-mTOR在HepG2和Hep3B细胞中的 表达较QSG-7701细胞均显著升高；LY294002和RAPA均呈剂量-时间依赖的抑制HepG2和Hep3B细胞生长。饱和效应浓度的 LY294002和RAPA作用24小时后，HepG2和Hep3B细胞均呈现明显的G0/G1期阻滞，处于S期的细胞比例较对照组显著减少 （P0.01）；两给药组中HepG2细胞和Hep3B细胞的凋亡率与对照组比较均显著增加（P0.01）；两给药组HepG2细胞的凋 亡率显著高于Hep3B细胞（P0.01或P0.05），并且HepG2细胞的凋亡率在RAPA给药组显著高于LY294002给药组 （P0.01），但Hep3B细胞的凋亡率在两组间无显著差异。饱和效应浓度的LY294002作用48小时后，HepG2和Hep3B细胞中 pAkt（T308，S473）和p-mTOR（S2448）的表达水平较对照组均显著降低（P0.01），饱和效应浓度的RAPA作用48小时 后，HepG2和Hep3B细胞中P-mTOR（S2448）的表达水平较对照组均显著降低（P0.01），而pAkt（T308，S473）的 表达水平较对照组均显著升高（分别P0.01）。 结论：（1）HepG2和Hep3B细胞存在PI3K/Akt/mTOR信号通路的组成性激活；（2）LY294002和RAPA能有效阻断HepG2和 Hep3B细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制HCC细胞的生长增殖，诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，且阻断效应与HCC细胞P53的表达有 关；（3）一定浓度范围内，HepG2细胞对PI3K/Akt/mTOR信号通路阻断剂的敏感性高于Hep3B细胞，RAPA对PI3K/Akt /mTOR信号通路的部分阻断效应优于LY294002。 目的：观察阿霉素（Doxorubicin，DOX）单用或与RAPA联合用药对HepG2和Hep3B细胞生物学行为及PI3K/Akt/mTOR信号通路活性的影响，探讨mTOR抑制剂增强HCC化疗药物疗效的相关作用机制。 方法：分别取对数生长期的HepG2和Hep3B细胞，以不同浓度的DOX单用或与RAPA（20 nmol/ml）联合应用培养48h或24h，以MTT法测定药物对HepG2和Hep3B细胞的增殖抑制作用，以流式细胞技术检测二者的凋亡情况，以 Western blot法检测者P-p70S6K（T389）、P-4E-BP1（S65）和pS6（S235/236）的表达改变。 结果：0.1562.5 mg/L浓度范围内，DOX能抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖，且呈浓度依赖性；DOX在0.62510mg/L浓度范围内，Hep3B细胞的相 对存活率显著大于HepG2细胞（P0.01）；与DOX单用比较，DOX（0.1562.5mg/L）与RAPA联用显著降低了HepG2和 Hep3B细胞的存活率（P0.01或P0.05），DOX（0.15610mg/L）与RAPA联用，Hep3B细胞存活率显著大于 HepG2细胞（P0.01）。DOX（0.15610mg/L）单用或与RAPA联用24h均可诱导HepG2和Hep3B细胞凋亡发生，且 随DOX浓度增加，凋亡牢升高；与DOX单用比较，DOX（1.2510mg/L）与RAPA联用，HepG2细胞捌亡率较显著升高 （P0.01或P0.05），DOX（2.510 mg/L）与RAPA联用，Hep3B细胞凋亡率显著升高（分别P0.05）；DOX（5.010mg/L）单用，HepG2细胞凋亡率显著大 于Hep3B细胞（分别P0.05），DOX（2.510 mg/L）与RAPA联用，HepG2细胞凋亡率显著大于Hep3B细胞（分别P0.01）。RAPA（20nmol/L）、DOX（2.5mg /L）以及二者联用均可导致HepG2或Hep3B细胞P-p70S6K（T389）、P-4E-BP1（S65）和pS6（S235/236）表达减 少，且以DOX与RAPA联用效应最为明显。 结论：（1）DOX可抑制HepG2和Hep3B细胞生长增殖，促进细胞凋亡，下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化程度；（2）DOX与 RAPA联合用药能显著抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖，促进细胞凋亡，下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化程度，并在一定浓度范围内表 现出协同效应；（3）在一定浓度范