氨基酸的纸层析.doc

生物化学实验报告 氨基酸的纸层析 一、实验目的 掌握氨基酸纸上层析的方法和原理，学会分析未知样品的氨基酸成分。二、原理 滤纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示： 原点到层析斑点中心的距离 Rf _原点到溶剂前沿的距离 物质结构、溶剂系统的物质组成等因素都会影响Rf值。 三、试剂和器材 1. 试剂 0.5%茚三酮溶液、标准氨基酸溶液 溶剂系统： 正丁醇88甲酸水(15：3：2，V/V) 2. 器材 层析缸、毛细管、电吹风四、操作步骤 1、取直径13cm圆形滤纸一张用铅笔过圆心做两条相互垂直的线，在距每条线上距离圆心1cm处打点作记，作为点样处，并分别在其边缘上标上测、谷、对、丙字样(注意：点样点要小，多次点样，吹干，混合氨基酸尤其要多点几次)。2、用打孔器在滤纸圆心扎一小孔，（约3-5mm直径）另取滤纸条卷成筒状捻紧如灯心，后用毛细玻管分别蘸取测定液、谷氨酸、对照液、丙氨酸溶液各一小滴在滤纸相应点样处点样。点样直径不超过3mm。3、将捻紧的滤纸条从滤纸相应点样背面插入小孔，突出滤纸面约0.5mm。4、加2.0ml层析溶剂于表面皿中，表面皿放在直径10cm的培养皿正中，将滤纸平放在培养皿上，使滤纸芯位于表面皿中央且浸入层析溶剂，取另一同样大小的培养皿反向盖上。5、待溶剂前沿距滤纸边缘3cm时，即可取出。用铅笔划出溶剂前沿后，用电炉烘干。6、将滤纸平方在培养皿上，喷雾0.1茚三酮乙醇溶液，再用电吹风烘干。观察出现的紫色弧形斑。计算各色斑Rf值。思考题：1. 什么叫做转氨基作用?答：转氨基作用是氨基酸代谢中的一个重要反应。 在氨基转移酶（转氨酶）的作用下催化某一氨基酸的-氨基转移到另一种-酮酸的-酮基上生成相应的氨基酸，原来的氨基酸则转变为-酮酸。氨基转移酶广泛分布于机体的各个器官、组织中。2.如何通过得到的弧形斑证明有丙氨酸的存在？答：不同的氨基酸具有各自独特的结构特点，它们在相同的层析溶剂中移动的速度和距离主要取决于其本身的结构。通过滤纸上所得实验条带和样品条带离圆心距离之间的比较，发现实验条带和丙氨酸所在条带处于同一个圆上，即离圆心的距离相同，因此，得出实验组溶质里含有丙氨酸。实验名称：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验目的： 1.掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义； 2.熟悉电泳仪器的使用和操作。试剂器材： pH8.6巴比妥缓冲液，醋酸纤维膜，血清蛋白，染色液。实验原理： 血清蛋白在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，分子大小、形状各有差异。在电场作用下，可在醋酸纤维膜上分离成。A、1、2、五条区带。电泳结束后，将醋酸纤维膜置于染色液。使蛋白固定并染色，再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别剪开，将其溶与碱液，进行比色测定，计算各区带的百分数。实验步骤：1、准备与点样 1）将已充分浸透的醋酸纤维膜取出，用滤纸吸去多余的缓冲液。在膜的无光泽面距一端处点样（膜不能折；在膜上标记记号）。 2）用点样器蘸血清少许（不能看见有液滴形成），按在点样处（点样要与膜边缘垂直，且大小均匀，点样条要细，点样量要稍微多点）。2、 电泳 将膜无光泽面向下，点样端置于阴极，膜与电极紧密接触（不能留有气泡），平衡5min。通电，电压100V时间1 h。3、染色 电泳结束，将膜放入氨基黑10B染色，3min后取出，漂洗，反复几次