中药药效研究技术规范若干问题的探讨

中药药效研究技术规范若干问题的探讨 北京中医药大学中药药理系孙建宁教授 中药新药的基本要求是安全 有效 可控和稳定 侯选样品 药效学 侯选药物毒性研究 一 药效学研究的基本目的 一 通过药效学研究确定有效性是否有效 作用的强弱 优缺点和特色 确定有无开发前景 重视前期药效的筛选 力求得到较准确的药效评价 设法找出主要药效学的特点 有效作用剂量范围 量效关系 有效作用时间长短 时效关系 二 提高临床疗效应充分运用现代科学特别是现代医学的理论 方法和手段 制定科学 严密 具有中医药特点的试验计划 建立与临床相符的 病 症 或 证 相似的动物模型与指标 对新药的有效性作出科学的评价 二 药效学研究的基本要求 试验负责人受试药物研究单位实验动物试验记录统计处理 三 药效学研究的方法及注意事项 药效研究参考资料 1 中药新药研究指南 药学 药理学 毒理学 中华人民共和国卫生部药政管理局 1994 66 672 中药新药研制开发技术与方法王北婴 李仪奎主编上海科学技术出版社2001 123 中药药效研究思路与方法陈奇主编人民卫生出版社2004 124 中药药理研究方法学陈奇主编人民卫生出版社2006 15 中药药理实验方法学李仪奎主编上海科学技术出版社2006 106 国内外研究论文 1 实验设计 符合中药特点 符合国家新药研究申报的有关规定 随机 对照 重复筛选 处方 工艺 有效部位 重视中药复方配伍规律性的研究 1 单味研究法 6 正交设计法 2 药对研究法 7 正交t值法 3 药物组间关系法 8 均匀设计法 4 撤药分析法 9 量效关系法 5 聚类分析法 撤药分析法 从复方中撤出一味或一组药进行实验 均匀设计法 按均匀设计表安排 实验次数与各因素所取水平数相等 如 治疗感染复方 五种中药X1 X2 X3 X4 X5 根据因素与水平 选用U11表设计 结果算得回归方程 有显著性意义 从标准相关系数可看出药物 抗炎 作用大小 进行优选 量效关系法 四君子汤 党参 白术 茯苓 甘草1 1 1 0 5巨噬细胞吞噬功能增强 调整甘草到1 3 功能减弱 当归补血汤 黄芪 当归5 1免疫增强作用 调整黄芪剂量 1 2 2 4倍 均作用不明显 有效部位的确认样品 粗制剂有效部位剩余部分剂量 二个剂量评价指标 与主要药效指标一致 2 动物选择 种类 实验常用小鼠和大鼠 豚鼠 家兔 狗品系 动物等级 二级动物即清洁动物 CL 性别 一般试验选用雌雄各半动物 数量 一般小鼠不得少于10只 大鼠为8只 猫 狗为4只以上 3 药效学研究内容的设计 根据主治 参考功能 选择试验方法针对性强 重点突出 主次分明 缺血性中风治疗的药效学研究 1 增加缺血区脑血流量2 神经细胞的保护治疗 中药治疗缺血性中风主要药效学研究方案 选用大鼠大脑中动脉血栓模型 middlecerebralarterythrombosis MCAT 和双侧颈总动脉阻断致不完全性脑缺 观察连续给药2 3天对局部脑缺血和不完全性全脑缺血性损伤的保护作用 1 防治缺血性中风药物研究常用动物模型 1 局灶性脑缺血动物模型微栓子栓塞阻断法开颅机械闭塞法血管内栓线阻断法化学刺激诱导血栓性闭塞法光化学诱导血栓形成法内皮素 1 ET 1 灌注诱导血管收缩法 2 全脑缺血模型大鼠两动脉阻断缺血模型大鼠三动脉阻断缺血模型大鼠四动脉阻断缺血模型小鼠断头缺血模型 人大脑血管系统 线栓模型制备 模 型 制 作 FeCl3贴敷致MCAT模型 2 评价指标 1 脑梗死范围 2 神经症状 3 脑血流量 CBF 或区域性脑血流量 ICBF 4 脑组织含水量 5 脑内神经递质 6 脑组织生化指标 包括能量代谢和毒性产物 如三磷酸腺苷 ATPase 磷酸肌酸 Per 乳酸 LA 乳酸脱氢酶 LDH 自由脂肪酸 FFA 脂质过氧化物 LPO 兴奋性氨基酸 EAA 及基因表达等 7 神经细胞病变程度 应进行定性 定量组织学观测 3 结合功效选做内容 益气活血微循环试验血小板聚集性试验血栓形成试验凝血时间 凝血因子的测定血液流变学试验清热解毒脑组织炎性因子 InfarctsizeofratswithtMCAO TTCstaining Sham Vehicle Sham Vehicle Normal 0 1 3 4 2 神经 评分 治疗抑郁症药效学研究 抑郁症发病的机制 单胺递质与抑郁症脑内去甲肾上腺素 NE 与抑郁症关系密切 5 羟色胺 5 TH 与抑郁症关系密切 两种甚或3种单胺神经递质系统功能失去平衡便会导致抑郁症 下丘脑 垂体 肾上腺 HPA 轴负反馈失调与抑郁症促肾上腺皮质激素释放激素 CRH 应激刺激 如低血糖 失血 剧痛以及精神紧张等 引起HPA轴兴奋性提高 然后通过CRH引起垂体 肾上腺皮质系统反应 CRH不仅能作用于内分泌系统 而且参与应激反应 过多的应激刺激会造成CRH的过度分泌和HPA轴亢进 到成年后其抑郁症发病机率会更高 从而出现一系列抑郁症状 如睡眠和饮食障碍 性欲下降和精神行为改变等 促肾上腺皮质激素 ACTH 在HPA轴中 ACTH的测量被证明在判定情感障碍性疾病中十分有用 因为HPA的功能阻断包括了脑垂体和中枢神经系统 有证据可以证明ACTH是可以影响动物甚至人的行为的 脑垂体ACTH的释放和肾上腺皮质醇并不只是单独的存在释放与反馈的作用机制 研究表明 在生理紊乱情况下 其他对肾上腺皮质醇的刺激会同ACTH共同发挥作用 肾上腺皮质激素抑郁症患者的肾上腺皮质增生约38 增生的程度与皮质醇有关 随着抑郁症状的缓解 这种增生也似乎随着皮质醇的正常化而逐步消失 这与HPA轴的慢性或持续活跃有关 许多研究者都证实 有HPA轴活动亢进的患者和一些抑郁患者中 这种脉冲式的皮质醇分泌节律更频繁也更持久 因此推测这种分泌方式可能参与了抑郁的发病 糖皮质激素受体抑郁病人的HPA系统常常可以出现一些明显的改变 并且可以被抗抑郁药所纠正 HPA轴活化的一个主要特征就是肾上腺皮质激素受体 GR 对ACTH产物即皮质醇的敏感性下降 其功能也降低 皮质激素的作用效果主要依靠细胞受体的调控 特别是GR 许多研究都表明抑郁患者的GR数量和功能下调 HPA轴与免疫机制有研究表明 重症抑郁是以HPA轴活动亢进和伴有IL 1 IL 2产物增加的免疫系统激活为特征的 已经知道IL 1 IL 2能够增强HPA轴在免疫反应中的活性 HPA轴与5 HT在抑郁的发病机制中 已经证实HPA轴和5 HT之间有着紧密的联系 皮质类固醇是通过糖皮质激素受体和盐皮质激素受体来调节5 HT的功能 主要是二者的比例发生改变 同时5 HT受体mRNA水平及传导功能降低 支持经典的抑郁发病过程中5 HT功能低下的学说 5 HT受体有许多亚型 每个亚型又可以分为次亚型 相互之间功能不同 脑细胞再生 凋亡与抑郁症近代神经科学发现脑细胞同样存在着凋亡与再生现象 二者的平衡是维持正常脑功能的重要因素 抑郁症患者脑内存在特定部位的脑萎缩现象 促使许多学者将研究注意力转向应激脑损伤和抗抑郁剂神经保护作用的研究上来 抑郁症的细胞分子机制 在信号转导水平上 抗抑郁剂长期用药后引起G蛋白偶联受体的腺苷酸环化酶 AC cAMP PKA信号通路活性增强 却降低PLC PKC信号通路的活性 据此 有的学者提出AC PKA与PLC PKC信号转导平衡失调是抑郁症发病的机制 在基因转录水平上 cAMP作为第二信使 它激活相应的功能蛋白CREB cAMP反应元件蛋白 继而作用在靶基因上 激活基因的表达 抗抑郁剂慢性用药后 海马中cAMP和CREB的mRNA含量增加 而且 脑源性神经生长因子 BDNF 及其受体trKB的mRNA也增加 脑内注入BDNF可显示抗抑郁作用 抗抑郁药物研究中常用的动物模型 药物诱发的抑郁模型 包括育亨宾增强 利血平拮抗 5 HTP诱发抑郁行为等 改变环境条件诱发的抑郁模型 如束缚 嗅球切除 隔离诱发过度活动 疲劳应激 行为绝望 慢性不可预知应激 慢性温和应激等 遗传行为抑郁模型 如游泳低活性 SwLo 模型 FSL Flinderssensitiveline 大鼠模型 后者因具有与人类抑郁个体相似的行为特征和对环境刺激 抗抑郁药物的反应性 因此被认为具有很强的实用性 针对相关靶点分子的基因缺陷动物模型 如interleukin 6 IL 6 knock outmice CREB deficientmice等 有效性评价 三个主要原则 现实有效性 建造有效性 预测有效性 即动物模型与抑郁症的临床特征具有相似性 即构建动物模型理论的合理性 即对抗抑郁药物的反应性 常用抑郁症模型 慢性轻度不可预见性应激抑郁模型 行为绝望抑郁模型 大 小鼠游泳试验 悬尾实验等 获得性无助抑郁模型 脑损伤模型 常采用切除双侧嗅球可使大鼠产生抑郁症状 并伴有活动过多的表现 药物相互作用模型 利血平拮抗 5 HTP诱导的甩头行为 高剂量阿朴吗啡拮抗等 遗传选择性抑郁模型 如对胆碱能剂高度敏感 适应能力极差的FlidersSensitiveLine FSL 大鼠 WistarKyoto大鼠等可作为遗传选择性抑郁动物模型 动物模型的建立及评价 用于药物筛选的模型 要求 经济简便 试验时间短 预测有效性高行为绝望 强迫游泳 Theforcedswimmingtest 悬尾试验 TheTailsuspensiontest 药物诱发 5HTP和利血平 用于行为药理及作用机制研究的模型 要求 临床抑郁症的关联性强 有效性高慢性应激模型嗅球切除模型 行为绝望型模型 14cm 20cm 10cm 25 6min 强迫游泳 悬尾试验 原理 动物置入不可逃避环境 游动 挣扎 试图逃脱 不动 放弃逃避的希望 行为绝望状态 模拟抑郁症状 应用注意 1 对多数的抗抑郁药物有效 但氟西汀受种属影响 对ICR无效 2 精神运动兴奋药物有阳性结果 需要运用开场装置或小鼠自主活动仪等观察小鼠的自主活动 以排除药物对此可能产生的影响 3 FST和TST均应当注意测试过程和程序参数对动物行为的影响 包括水温 水深 筒的直径 鼠尾固定的松紧程度 倒悬小鼠与周边的距离等 以增加预测药物效果的可靠性 举例 药物对绝望行为的改善 小鼠强迫游泳 举例 药物对绝望行为的改善 小鼠悬尾 造膜方法 利血平模型 利血平2 5mg kg ip 5HTP诱导甩头模型 帕吉林100mg kg ip 2 5h后给与阳性药和受试药 45min后5HTP10mg kg ip 15min后观察小鼠的甩头次数 利血平 5HTP小鼠模型 原理 利血平能耗竭脑组织中的单胺类神经递质 其作用可以被具有增强单胺能传递的抗抑郁药物所拮抗 帕吉林是一种单胺氧化酶抑制剂 能升高突触间单胺递质 5HTP为5HT的前体 可以特异性的增加脑组织中5HT 导致动物出现甩头行为 而增加5HT释放的抗抑郁药物可以增强这种行为 用于评价药物对单胺递质的影响 举例 对利血平模型行为的影响 p 0 05与利血平组相比 p 0 01与利血平组相比 p 0 05与帕吉林和5HTP组相比 p 0 01与帕吉林和5HTP组相比 四逆散能明显增高利血平模型小鼠的体温 p 0 01 减少眼睑下垂动物个数 举例 对5HTP模型行为的影响 SNEC能明显增加5HTP诱导小鼠的甩头次数 药物 拮抗利血平耗竭和5HTP增强 引起脑内单胺类神经递质的变化 特别是5HT 育亨宾增强模型 2受体拮抗 NE的释放 动物心率 血压 致死 激动NE能的抗抑郁药有增强作用 高剂量阿扑吗啡拮抗模型 DA受体拮抗 高剂量引起小鼠体温降低 刻板症和攀顶等反应 抗抑郁药有拮抗作用 注意 该类模型的假阴性结果 假阳性结果出现较多 因此不宜单独使用 抗抑郁活性必须结合TST和FST进行评价 慢性应激模型1 方法 模型组动物遭受随机刺激 程序有两种 未预知中等强度的应激模型 包括电击 禁食 禁水 45 热应激 冰水游泳 昼夜颠倒 水平高速摇晃 夹尾 束缚等 未可预知的长期温和应激模型 禁食禁水 45 倾斜饲养 配对饲养 潮湿饲养 白噪声 频闪照明等 2 原理 大鼠在遭受慢性刺激后的行为与抑郁症病人的临床表现有相关性 大鼠在旷场中活动减少反映了抑郁症病人精神运动迟滞的症状大鼠糖水摄入的减少反映了抑郁症患者兴趣缺失 Open Field行为测试 以动物穿越底面方格为水平活动得分 三爪以上跨入 以直立次数 两前肢离地1cm以上 为垂直活动得分 测定动物5min内行为 蔗糖水消耗测试 每次禁水后 给与1 蔗糖水 测定1小时内饮用量 3 行为学测试方法 4 注意 正式实验前适应性饲养一周 期间进行蔗糖水消耗训练 根据Open Field测试结果 选择得分相近的大鼠 随机分组 孤养 进行Open Field行为测试时 室内要隔音 每次测试后均需将动物排泄物清除干净 以免环境因素对动物的行为产生影响 大鼠对蔗糖消耗的观测 若直接给与蔗糖水 应当多次测量 动态观察 也可以一次同时给与一瓶蔗糖水 一瓶自来水 观察大鼠对蔗糖的偏嗜度 偏嗜度的计算方法 蔗糖水饮用量 蔗糖水饮用量 自来水饮用量 5 举例 慢性应激大鼠模型 Openfield 敞箱试验 大鼠兴趣缺失的影响 慢性应激大鼠模型 1 糖水消耗 嗅球切除模型 1 方法 大鼠用水合氯醛300mg kgi p 麻醉 固定在脑立体定位仪上 消毒头部皮肤 沿正中线切开 将皮肤剥至两边 用棉球搽去骨膜 在前囟前8mm 正中线两侧2mm 用牙科钻钻两个直径约2mm的孔 用特制的电烙铁损毁两侧主嗅球 术后维持室温25 以保持体温 青霉素钠i p 3d防止感染 经过2W的恢复后进行实验 大鼠颅骨主要解剖特征与钻孔位置 嗅球在颅腔中的位置 2 原理 嗅球是嗅觉信息的第一个处理点 如图 嗅球的破环完全阻断了动物的嗅觉传递信号 对发现食物 环境定向和危险评价以及分辨同伴或敌人将产生重要影响 因此 大大影响了动物体验自己以及环境的方式 3 行为学测试 动物嗅球损毁后表现出下列的行为变化 open field的高活动性 夜间活动性增高 记忆缺陷 如消积回避行为 Morris迷宫 8 臂辐射迷宫 4 举例 Morriswatermaze 定向航行 空间搜索 嗅球损毁大鼠Morris水迷宫中学习记忆行为 图 四逆散有效部位对嗅球损毁大鼠Morris水迷宫中空间搜索行为的影响 迷宫分为四个象限 第 象限水面下隐藏平台 测试时间为90s A 假手术组 B 模型组 C 氟西汀组 D 四逆散有效部位大剂量组 E 四逆散有效部位中剂量组 F 四逆散有效部位小剂量组 迷宫内的曲线表示3d训练移去平台后 大鼠寻找平台的搜索路径 模型组大鼠的搜索趋向于水迷宫的边缘区域 氟西汀组和四逆散有效部位组的搜索路径趋向于中央区域 E F D C A B 模型活动兴趣学习记忆行为绝望 利血平 5HTP 慢性中等应激 慢性温和应激 嗅球切除 有效药物 单胺能如 HT 5HT1A 转录因子 如CREB 学习记忆障碍和兴趣缺失 神经营养 如BDNF Stress 增加海马神经元发生 抑郁症 采用能够反映中药特点的试验方法及动物模型 抗病毒感染中药复方研究实验设计急性感染期用药1 对病原体的抑制作用2 对症治疗退热作用抗渗出抗炎作用抗肺纤维化作用抗多脏衰作用 1 感病毒所致小鼠肺炎的保护作用 选择流感病毒肺炎模型 以肺指数 死亡率 血清NO含量为观察指标 2 抗高热作用 对毒素所致家兔发热模型的退热作用 酵母所致大鼠发热模型的退热作用 3 抗炎作用 急性炎症 对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响 常规药理试验 对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响 常规药理试验 4 针对呼吸窘迫 选择油酸致呼吸窘迫症模型油观察所选药物对呼吸功能的影响 5 针对呼吸窘迫 选择油酸致呼吸窘迫症模型油观察所选药物对呼吸功能的影响 6 针对肺纤维化 选择内毒素吸入性肺炎损伤模型以BALF中弹性蛋白酶 蛋白含量为观察指标对内毒素所致大鼠多脏器衰竭的保护作用 选择内毒素或角叉菜胶多脏器损伤模型观察所选药物对重要脏器的保护作用 评价指标 生化指标 ALT AST GREA BUN 脏器指数 心 肝 脾 肺 肾 血象测定 WBC及分类 RBC PLT 凝血时间 恢复期用药1 对过量甲状腺激素所致阴虚模型的改善作用2 对过量皮质激素所致阴虚模型的改善作用3 对过量皮质激素所致消化道功能障碍的改善作用4 强壮作用 以耐缺氧时间 小鼠游泳时间为观察指标5 对免疫功能的影响 更年期综合征药效研究思路与方法 更年期女性出现的的证候群 常见的有潮红潮热 出汗 烦躁易怒 失眠健忘 头晕 头疼 腰疼 骨质疏松等 相当于中医学上的 经断前后诸证 或 绝经前后诸证 妇女更年期是指妇女从性成熟期逐渐进入老年期的过渡时期 包括绝经前期 premenopause 闭经前2 5年 平均4年左右 绝经期 Menopause 持续闭经第一年 绝经后期 postmenopause 闭经后15年至老年 更年期又被称为围绝经期 随着人们生活质量的提高 生理性绝经年龄有推后倾向 病因 病机 一 雌激素分泌减少 下丘脑 垂体 性腺轴平衡失调 更年期女性体内雌激素水平严重低下与更年期综合征的发生密切相关 雌激素受体广泛分布于女性多部位组织和器官的细胞膜和细胞核 新近发现雌激素受体也广泛分布于大脑中如海马和皮层等与情绪调节有关的脑区 当雌激素减少时 这些组织和器官的功能可能出现紊乱或退变 导致神经内分泌等多个系统出现不平衡 进而出现一系列神经内分泌失调的症状 1 卵子消耗 发生绝经的原因是由于卵巢中对促性腺激素有反应的卵母细胞几已耗尽 少数卵母细胞对促性腺激素又无反应 生育年龄时期因排卵和卵泡闭锁而使卵母细胞数目日趋减少 几乎全部卵母细胞因卵泡闭锁 follicularatresia 消灭 仅很少部分卵母细胞真正用于排卵 闭锁卵泡颗粒细胞出现凋亡 bcl 2基因mRNA表达下降 提示卵泡闭锁的本质可能是其细胞发生凋亡 雄激素促进卵泡闭锁 雌激素则对抗卵泡闭琐而呈相反的效应 雌激素对抗雄激素样作用及促进卵泡发育的机理 可能与调节内源性核酸内切酶的活化和bcl 2基因表达有关 2 自由基含量改变 动物实验证实抗氧化酶 如SOD CAT等 活性的下降 氧自由基含量的增多致黄体溶解及黄体酮生成减少 氧自由基还可引起卵泡闭锁 绝经前期SOD和GSH Px抗氧化的活性随年龄增长逐步减弱 且GSH Px的活性在绝经后期还会进一步降低 3 线粒体DNA缺失 研究妇女卵巢组织的mtDNA提出液 用PCR方法扩增 发现绝经前后卵巢mtDNA缺失 可能mtDNA缺失的累积和mtDNA编码的蛋白质合成产物的减少影响卵巢功能 4 血管改变 卵巢内有丰富的血管 以维持卵泡的生长 类固醇激素的分泌和卵巢对促性腺激素的敏感性 研究发现30岁时妇女的卵巢门和髓质的一些螺旋动脉的内膜开始增厚 弹性板层已有裂隙 卵巢的血液供应减少 从而影响卵巢 5 免疫因素 通过外周淋巴细胞亚群的分析显示 无论更年期症候群发生与否 两组更年期妇女免疫功能衰退 即在机体免疫调节过程中 调高免疫应答能力的细胞群体 如CD3 及CD4 细胞 减少 而调低免疫应答能力的细胞群体 如CD8 细胞 增加 且IL 2活性下降 说明衰老卵巢与机体免疫间的关系 二 神经递质变化 更年期妇女阴虚火旺者血清FSH LH含量明显升高同时尿儿茶酚胺升高 阴虚肝火旺者且尿17 羟皮质类固醇增高 妇女进入更年期后 雌激素分泌减少 垂体促性腺激素分泌亢进 同时有中枢神经递质的变化 如5 HT含量下降 P物质升高和 内啡肽 EP 降低等 雌激素及其受体在中枢内有广泛分布 并与免疫 内分泌物质共存 研究思路 一 对神经 内分泌 性腺轴调节作用中药复方 补肾中药 能同时调节神经 内分泌 免疫网络的各个环节 具有多途径作用机理和整体调节的特点 明显改善更年期综合征的主要症状 二 调节植物神经功能 更年期综合征的许多症状如潮红 潮热 失眠等是由于植物神经功能紊乱引起的 中药能有效地调节植物神经功能 改善更年期的临床症状 安神药 用切除双侧卵巢并加服热性中药的方法制成阴虚内热证大鼠模型 灌服由地骨皮 女贞子为主制剂 使阴道上皮呈现不同程度的角化 增加子宫重量 使血清促黄体生成素 LH 促卵泡刺激素 FSH 泌乳素 PRL 含量 使血浆 NE 肾上腺素及脑组织5 HT含量降低 从而降低交感兴奋性 三 对自由基的影响 自由基能促使卵细胞凋亡 加速卵巢衰老 更年平调液能增强更年期大鼠SOD和GSH PX等抗氧化酶活性 降低自由基含量 更年安 能抑制动物脑 心 肝组织内和血清中过氧化脂质及脑 心 肝组织内脂褐质的生成 并提高小鼠红细胞内超氧化物歧化酶的活性 对小鼠全血中谷胱甘让过氧化物酶活性也有升高作用 四 补充植物性雌激素 西方妇女的更年期发生的时间较东方女性早 其主要原因认为东方女性所吃的大豆中含丰富的具有雌激素样作用的物质 大豆黄酮类植物性雌激素 可以补充体内分泌不足的雌激素 从而延缓更年期的发生和减轻症状 许多中药如鹿茸 肉苁蓉 人参 当归 补骨脂等具有雌激素样作用 研究方法 一 实验动物的选择更年期综合征的动物以大 小鼠较为常见 其他动物如兔 猴也可用 小鼠和大鼠常作去卵巢试验和作雌激素检查 只有大鼠和猴子可出现绝经后潮热现象研究 二 动物模型 一 自然衰老模型 一般认为大鼠3 6月龄为青年期 8 12月龄为中年期 24月龄以后为老年期 由中年向老年的过渡时期为老年前期 通常可选择12 18月龄的雌性大鼠作为女性更年期综合征的动物模型 由于此阶段的大鼠的生殖内分泌功能衰退的表现与更年期妇女极为相似 雌激素水平下降 阴道上皮细胞萎缩 变薄等特点 但由于一些因素诸如饲养及购买费用较高 动物数量来源相对较少限制了这一模型的应用 二 去势模型1 原理 切除动物性腺器官 使性激腺分泌性激素停止 血液中性激素明显下降 2 方法 成年雌性大鼠 小鼠以乙醚麻醉 腹位固定 并以浸透乙醚的棉球放置动物的口鼻部维持麻醉 或以戊巴比妥麻醉 然后从背部最末肋骨下 腋中线和距脊柱外侧切口 视野中可见一乳白色发亮的脂肪团 卵巢既包埋其中 用小镊子轻轻夹住脂肪团拉出切口外 分离脂肪团 便可见到一团细线状不规则呈黄红色的卵巢 行摘除术 三 慢性应激1 电刺激法将动物 小鼠或大鼠 放入药理 生理实验多用仪的刺激盒内 动物脚站在刺激电极栅网上 开动刺激电极 刺激电极36v 单击或双击 连续1 3分钟 每天刺激1 3次 根据情况可以剌激强度 调整次数 持续时间 2 制动法将动物 小鼠或大鼠 捆绑或放入制动瓶内 制动瓶可以用塑料制成 将动物放入使其不能动弹 每天1次 每2 3小时 3 吊尾法将动物 小鼠或大鼠 尾尖部用胶布固定于棒上 头部下垂悬吊 下部制一水盆 使动物必须抬头才不致于鼻部进入水中 每次悬吊1 3小时 以上方法连续10 15天即可引起动物生殖内分泌变化 四 去势加慢性应激更年期综合征患者犯病原因也有社会精神因素 因此采用切除卵巢小鼠加应激法 将去卵巢小鼠放入电刺激盒中 接受电刺激应激 刺激电压36v 每秒点激1次 连续点激10次 隔50秒再点激 10次 如此进行10次循环 每天1次 连续10天 小鼠出现自主活动增加 戊巴比妥钠睡眠潜伏期明显延长 睡眠时间缩短 血清E2降低而FSH升高 五 X线造模性成熟期大白鼠卵巢经X线照射后 大白鼠卵巢萎缩 雌激素水平低下 部分植物神经功能紊乱 六 去胸腺法造成衰老动物模型人体的衰老首先是胸腺衰老继而引起其他脏器的衰老 用切除胸腺大鼠的方法制成衰老模型 性功能紊乱 卵巢萎缩退化 E2水平下降 七 快速撤退吗啡成瘾大鼠的吗啡造模急性撤退对吗啡成瘾大鼠的吗啡以造成模型 因为当潮热发生时 其皮肤温度 心血管和神经内分泌变化与更年期妇女很相似 因此 认为可以用快速撤退对吗啡成瘾大鼠的吗啡型以研究更年期潮热发生的神经机制 三 客观指标 一 与激素及神经递质有关的实验指标血清E2 FSH LH 皮质酮 血清或中枢神经NA DA 5 HT等指标 血清E2 FSH LH 皮质酮 EP测定用测试盒 使用放射免疫测定仪 按说明书操作进行测定 二 形态学观察利用光镜和电镜观察肾上腺 卵巢 子宫及相关组织结构的变化 组织化学 包括免疫组织化学 观察卵巢 子宫 阴道等组织中受体变化 三 行为活动行为活动包括1 睡眠时间的测定 包括延长戊巴比妥钠睡眠时间的试验和对戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响 2 活动次数的测定 以镇静试验方法观察药物对动物自发活动的影响 四 卵巢基因及生物因子变化更年期的卵巢基因及生物活性因子研究还刚刚开始 中药对这些变化的影响尚在起步 分析评价 定位 雌激素样作用改善症状 中药对功能失调性子宫出血药效研究方案 功能失调性子宫出血 DysfunctionalUterineBleeding DUB 又称功血 是指调节生殖的神经内分泌失常而非生殖器官本身的器质性病变或全身疾病引起的不正常子宫出血 可表现为出血量过多 出血持续时间过长和 或 间隔时间过短 子宫出血是一种临床症状的总称 并非是一种疾病的专有名称 病因 病机 一 性激素分泌失调子宫出血是受雌 孕激素直接调控的 由雌激素刺激而过度增生的子宫内膜需要更高水平的雌激素支持 此时 即使雌激素水平并未下降 仍然会有雌激素的相对不足而发生出血 又称为 雌激素突破性出血 有排卵功血时 黄体过早退化致黄体期过短 月经频发 孕激素持续分泌则致黄体期 经前 出血 经期延长 淋漓不止 或以上两种情况并存 可能是雌激素或孕激素分泌不足引起 雌激素分泌不足或撤退时 子宫内膜则失去激素的支持而发生脱落出血 称为 雌激素撤退性出血 孕激素分泌不足时 则使子宫内膜分泌期改变不完全 腺体 间质和血管发育不成熟 且由于孕激素和雌激素非同步性撤退 造成子宫内膜不规则剥脱而异常出血 二 前列腺素作用前列腺素 PGs 和前列环素 PGI2 在调节月经中起重要功能 通过调节子宫血量 螺旋小动脉和微循环 肌肉收缩活性 内膜溶酶体功能和血凝纤溶活性等5个方面影响子宫内膜出血功能 功血患者PGI2和TXA2的代谢产物6 Keto PGI TXB2比值升高 导致血管扩张 血小板聚集功能受抑制 月经增多等 用前列腺素合成酶抑制剂治疗 可明显减少功血出血量 亦可证实前列腺素参与调节内膜的出血 三 子宫内螺旋小动脉结构和功能异常研究发现 正常子宫内异常 增生过长 子宫内膜的螺旋小动脉结构和形态有明显差异 螺旋小动脉异常 干扰子宫内膜微循环功能 影响内膜功能层剥落和剥离面的血管和上皮组织的修复 影响血管舒缩功能和局部血凝纤溶功能导致异常子宫出血 四 子宫内膜细胞溶酶体功能异常如前文所述 当功血时雌 孕激素比例失调 将破坏溶酶体膜的稳定性 导致大量水解酶释放和磷脂酶A2的释放 促进PGS的合成 引起子宫内膜细胞破裂 内膜层崩塌 坏死和出血 五 L型菌的作用文献 6 7 8 报道通过对功血患者子宫内膜病原微生物培养 发现有大量L型菌长丝体 巨型体 圆球体 棒状体和原生小体 尤以出血区明显 病原微生物培养和与组织细菌学检查具有高度一致性 Madoff指出L型菌在子宫内膜对卵巢激素反应失常 加重月经异常的子宫出血 提示L型细菌可能是顽固性功血久治不愈的原因 六 内啡肽的作用 内啡肽对下丘脑 垂体系统及生殖激素促性腺激素释放激素 GnRH 促性腺激素 GnH 呈抑制性调节作用 影响脉冲释放节律及阻抑排卵 提示 内啡肽参与了功血的形成和发展 可能是某些因素使 内啡肽浓度升高 影响了大脑皮层及下丘脑 对GnRH释放呈抑制性作用 使月经周期不能形成黄体生成素 LH 高峰 以致卵巢不能排卵 孕激素缺乏 子宫内膜受雌激素的影响而波动 致月经紊乱 七 凝血障碍和纤溶系统激活通过对凝血和纤溶系统激活作用的观察表明 功血时常伴有 凝血因子 缺乏 血小板减少 贫血和血小板无力症 内膜纤溶系统功能亢进 研究显示 由于某些因素的作用 致使宫内膜局部组织纤溶酶原激活物 tPA 水平增高 促使宫内膜上纤维蛋白纤溶酶活性增高 血管内血栓分溶解 增加月经失血量 同时 血管外的蛋白酶 高水平的组织纤溶酶原激活物 tPA 的活性也可能促进子宫血管外糖蛋白的降解和胶原酶原的激活 使基底上 型胶原分解 造成子宫内膜脱落的延长或增大脱落范围 增加月经失血量 八 子宫内膜内皮素的作用内皮素 endothelin ET 也是月经前使子宫内膜血管收缩的重要物质 同时在月经后使子宫内膜基底层小动脉收缩 有助于出血的停止 并对月经后期子宫内膜的修复和再生有重要作用 研究方法 一 实验动物的选择研究功能失调性子宫出血 动物选择以大 小鼠 家兔较为常见 二 动物模型 一 未成年动物模型1 原理 未成年雌性动物 其雌激素水平较低 对卵巢 子宫等生殖器官影响较小 运用能够影响体内雌激素的药物 通过观察卵巢 子宫重量及对卵巢黄体生成的影响 从而说明该药是否能够调节神经内分泌的功能 2 方法 取未成年小鼠 按所需要求给药后 将小鼠处死 取其子宫及卵巢称重 并观察卵巢黄体的生成情况 二 去势动物模型1 原理 切除动物性腺器官 使性腺分泌性激素停止 血液中性激素明显下降 通过考察对子宫重量 雌孕激素含量及雌孕激素受体含量的影响 以观察药物的作用 2 方法 成年雌性小 大 鼠 麻醉 腹位固定 在背部中三分之一处 即最后肋骨稍后方 为中心剪毛 用碘酒 酒精局部消毒皮肤 自腰椎沿背正中线向下作纵行切口2 3cm 切开皮肤 用圆头手术剪开腰肌 用自制小拉构 曲别针 扩张创口 立即可见位于两侧肾脏下方脂肪组织中呈浅粉红色的卵巢及紧密相连的子宫角 在卵巢上部的血管和下部输卵管部位作两个结扎 用环形眼科镊摘除卵巢 也可用眼科小剪将卵巢剪去 用同样的方法摘除另一侧卵巢 把脂肪组织复纳入腹腔 检查有无出血 将腹膜与筋膜一起缝合2 3针 撒以消炎粉 缝合皮肤 三 模拟子宫出血模型取妊娠7日大鼠灌胃米非司酮和米索列醇 引起不完全流产模型 置棉球于阴道内 一定时间后取出 用分光光度法测定吸收度计算出血量 25 以考察药物对子宫出血的止血作用 四 各种创伤出血模型以创伤方法导致动物出血 记录自创伤出血开始至血液凝固所需时间即为出血时间 最常用为小鼠断尾法 即剪断小鼠尾端 1 3 观察自剪断至出血停止的时间 本法考察对血管血小板 凝血因子等综合作用 五 抗凝药物如肝素所致出血模型1 原理 肝素是体内重要的抗凝物质 观察药物对肝素等抗凝物质作用的影响 可以确定药