实验操作基本规范-转.doc

实验一 实验操作基本规范行为规范各人自用的药品各人负责，未经本人许可，别人不可外借。 公用药品由指定人员负责。未经负责人许可，不可外借, 外借药品应该以分装形式分发。 操作基础取液不可直接把枪探入试剂瓶。应从试剂瓶倒少许入烧杯等容器再取样 新进的蛋白酶等公用的试剂要分装保存。 实验应该考虑空白和对照的，空白没做好前不能做样品。 能用天平和密度表换算的情况下，尽量用天平而不是容积型的量器 本实验注意事项超净工作台的使用：A键开关电源，同时开启紫外灯（使用前开启紫外灯半个小时，工作时应把该灯关闭） B、C键调节风力大小 D键关闭紫外灯 使用超净台时，应注意观察紫外灯是否已经关闭！ 摇床和恒温培养箱可放置过夜使用，但鼓风干燥箱在离开实验室应该关闭其电源。干燥箱的设置温度不可超过70度。（已经设置好，无须再调整干燥箱温度） 可调电炉，切勿将电线接触炉壁，小心使用电炉，不可将附近的窗帘等易燃物点燃。 电泳边的试剂有毒，使用时小心。 三层架的第一层放置干净的器皿，第三层放置药品这些药品十分昂贵，使用时切勿浪费。 PE手套用于做有毒实验，乳胶手套（较贵）用于做含有腐蚀性药品的实验。 移液枪的使用：抽屉里有数把无盒装的移液枪可使用，另两把装于盒中仅能用于PCR实验，桌上的5把移液枪用于做分子生物学实验，不可随便使用。对于挥发性试剂应用特定的移液枪。 洗涤器皿：先把器皿用肥皂水浸泡过夜，再用清水洗涤两次，最后再用蒸馏水洗一遍，最后用干燥箱干燥。 电子天平：称量较贵的药品时，应注意少量多次称量，避免浪费。若称量过量时不可将药品重新放回药盒中，以免污染药品。药勺不可交叉使用，使用完后用水冲洗干净，然后用纸擦干净。称量有毒药品的用具应经过特殊处理。 电冰箱：电冰箱里面有强腐蚀性药品和一些贵重试剂，切勿将其电源关闭。开关冰箱门应轻缓。 水槽：在水槽中倒入有毒废弃液后，应用大量水冲洗。 垃圾：垃圾应该分类放置，一个用于放置有毒药品，一个放置废弃培养基，一个用于放置生活垃圾。 药品的标注：配制药品本人应该在药品上贴上标签，写上配制者姓名、配置时间、试剂名称。 开水：烧完开水应该把开水放置于对面没有实验的桌子上。避免饮用水污染，保证试验人员的身体健康。 最后离开实验室的人应该检查实验室的窗户，电源，水源有无关好，切记关掉干燥箱电源。 微波炉不可放入任何金属物品。只能用于玻璃或者塑料。 做完实验，应清理台面，尤其要处理掉有毒物品，避免给他人造成损害。 注意试验室的告示和各种说明。 灭过菌的器皿不可随意打开，避免污染。 注意安全，对于任何不了解的药品或者仪器设备，不可触碰，避免给自己或者试验室造成损失。 分子生物学实验室的常规仪器设备及有关操作【实验目的】（1）了解实验的常规仪器、设备、耗材。（2）掌握本实验所用仪器的功能和使用方法。【实验内容】一、验室的常规仪器、设备(一) 温度控制系统：1. 冰箱: 根据药品、试剂及多种生物制剂保存的需要，必须具备不同控温级别的冰箱，最常使用的有：4、-20、-80冰箱。4适合储存某些溶液、试剂、药品等。-20适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。-80适合某些长期低温保存的样品、纯化的样品、特殊的低温处理消化液等的保存。0-10的冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。2液氮罐：有些实验材料、某些器官组织、细胞株、菌株及纯化的样品等，要求速冻和长期保存在超低温环境下，就需要一个液氮罐（-196）具有经济、省力和较好地保持细胞生物学特性的优点。3培养箱：37恒温箱用于细菌的固体培养和细胞培养。CO2培养箱适用于培养各种细胞，可恒定地提供一定量的CO2（通常5%），用来维持培养液的酸度（pH值）。37恒温空气摇床可进行液体细菌的培养。4. 水浴锅：用于保温。25-100水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反应等试验的保温。25-100水浴箱用于常规试验。5. 烘箱：主用于烘干实验器皿，有些需要温度高些，有些需要温度低些。用于RNA方面的实验用具，需要在250烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42-45的烤箱中进行烘干。（二）水的净化装置：随着分子生物学的飞速发展，许多实验对水纯度的要求越来越高。1. 蒸馏水皿：单蒸水常难以满足实验要求。双蒸水、三蒸水配液，许多实验要去离子水。多次蒸馏水可除去水中挥发性杂质，不能完全除去水中溶解的气体杂质（Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mo()）。2. 离子交换器：去离子水用离子交换法制取的水，称去离子水。去离子效果好，但不能除去水中的非离子型杂质，其中常含有微量的有机物（树脂等）。3超纯水：用蒸馏水、离子交换水、反渗透纯水做为供水，磁铁耦合齿轮泵作用使水循环。用于PCR、PCR氨基酸分析、DNA测序、酶反应、组织和细胞培养等。（三）菌消毒设备：分子生物学所用大部分试剂，而且实验用具都应严格消毒灭菌。1蒸汽消毒锅：用于小批量物品的随时消毒。大批实验物品、试剂、培养基可使用大型消毒且定时进行消毒2. 紫外线：75%乙醇 、0.1%SDS（消毒剂）一些耐高压、高温消毒且可用紫外线照射或乙醇和SDS浸泡。紫外线照射使用方便，且很方便，但灭菌效果与距离有关，且产生臭氧污染安全，用于无菌室，超净台和塑料用具的消毒。3. 滤器滤膜：不耐高温、高压的试剂用其处菌。4. 煮沸消毒：主用于金属器械和针急需时采用。（四） 计量系统：1. 称量系统：（各种天平）台秤、托盘天平、钮力摆动天平、光电分子天平、精密电子分析天平2. 液体体积的度量：精：量筒、移液管、微量取液器粗：刻度试管、烧杯、锥形瓶3. pH值测量：pH计：测定溶液中H+的直接电位的仪器，主要通过一对电极，在不同的pH溶液中产生不同的电动势用pH值表示出来。pH试纸：只适用于培养液、酚饱和液、缓冲液或其它试剂溶液的pH值的粗略估计。而大部分试剂的配制要求严格的pH值，需精确度高（小数点后两位）的pH计。4. OD值测量：光密度、分光光度计是利用物质在可见光和紫外线区域中的吸收光谱来鉴定该物质的性质及其含量的一种仪器。它是由光源、单色器、吸收池、接收器、测量仪表或显示屏幕所组成。OD值是许多溶液中溶质定量的方便指标之一，通过所产生的单色光而测定某一溶液对该单色光的吸收值，利用它可进行核酸溶液定量和纯度的初步判断。（五）离心机：离心技术是研究生物的结构和功能中不可缺少的一种物理技术手段。因为各种物质在沉淀系数、浮力、和质量等方面有差异，可利用强大的离心力场，使其分离、纯化和浓缩。目前有各种各样的离心机。可供少于0.05ml到几升的样品离心之用。离心技术应用广泛，包括收集和分离细胞、细胞器和生物大分子等。据其转速的不同，可分为以下几种类型：1. 普通离心机：最大转速6000 r/m ，最大离心力6000g医用或台式离心机：是离心机中最简单而廉价的，最常用于收集快速沉降系数的物质，如红细胞、粗大的沉淀物、酵母菌和细菌等。低速冷冻离心机：主要用于细胞、细胞核、细胞膜和细菌的沉淀和收集等。 22. 高速离心机：最大转速25000 r/m ，最大离心力89000g有冷冻和常温两种，多用于制备和手收集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸铵沉淀物以及免疫沉淀物等。3. 超速离心机：最大转速9000 r/m ，最大离心力694000g。4. 台式超速离心机：最大转速12000r/m ，最大离心力625000g。（六）超净工作台：内有紫外灯、照明灯、还应有酒精灯火焰、75%乙醇等灭菌的设备，是一种提供局部洁净度的设备。其原理是鼓风机驱动空气，经过低、中效的过滤器后，通过工作台面，使实验操作区域成为无菌的环境。超净台按气流方向的不同大致有几种类型：侧流式：净化后气流，从左侧或右侧通过工作台面，流向对侧，或者从上往下或从下往上流向对侧，他们都能形成气流屏障而保障台面无菌。缺点：在净化气流和外边气体交界处，可因气体的流向而出现负压，使少量的未净化气体混入，而造成污染。外流式：气流是面向操作人员的方向流动，从而保证外面气体不能混入。缺点：在进行有害物质实验时，对操作人员不利，但可采用有机玻璃把上半部分遮挡起来，使气流往下方流出。实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA1. 实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。2. 实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于DNA分子本身的大小和构型。溴乙锭是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，它与DNA的结合几乎没有碱基序列的特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插于一个溴乙锭分子。与DNA结合的染料在紫外线下呈现橙色荧光。3. 实验设备移液器，tip头，水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，50ml三角瓶4. 实验试剂琼脂糖，1TAE（Tris-乙酸 0.04M，EDTA 0.001M， pH值为8.2），1mg/ml溴乙锭，上样缓冲液。EB一般在凝胶或电泳缓冲液中的终浓度为0.5g/ml，EB见光易分解，故应在棕色试剂瓶中于4条件下保存。 电泳缓冲液（50TAE）：242 gTris，57.1 ml冰醋酸，100ml 0.5 M EDTA（pH=8.0）。 上样缓冲液的功能：增加样品的密度保证样品沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；能明确显现样品在电泳胶上泳动位置。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的迁移速率是二甲苯氰迁移速率的2.2倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。 5. 实验步骤（1）用透明胶带将胶板的两端封好。（2）称取0.16 g琼脂糖于50 mL三角瓶中，加入1TAE 缓冲液 20 mL，配配制0.8 %的琼脂糖凝胶，在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。融化的琼脂糖凝胶保鲜膜通气孔（3）待琼脂糖溶液冷却至60 左右时，加入2 L溴化乙锭（EB）充分混匀。梳齿板透明胶带1mm左右梳齿板与底板间距离融化的琼脂糖凝胶（4）在距底板0.51.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶槽中，凝胶厚度在3-5 mm之间。（5）凝胶完全凝固后（室温下3040 min），去掉透明胶，小心将胶板移至装有1 TAE buffer的电泳槽中，轻轻拔去梳子，往电泳槽中注入1 TAE电泳缓冲液，没过胶面约1 mm。（6）1-5 L DNA样品与溴酚蓝混合后，用微量移液器慢慢将混合物加入上样孔中。（7）盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极（红线）移动。采用60 V电压进行电泳。（8）当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约半小时），切断电流，取出凝胶板，在紫外凝胶成像仪下观察。实验四 质粒DNA的提取（碱裂解法）1. 实验目的了解碱裂解法提取质粒的基本原理和主要应用，掌握碱裂解法提取质粒的实验方法和各种试剂在提取过程中的作用。2. 实验原理碱裂解法是利用细菌染色体DNA与质粒DNA结构的大小差异来分离质粒DNA的。碱性（pH 12.012.5）条件可以破坏碱基配对，宿主和质粒DNA的碱基之间的氢键被破坏。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），共价闭合环状的质粒DNA会迅速准确地恢复配对，重新形成完全天然的超螺旋分子；而较大的细菌染色体DNA分子则难以复性，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇沉淀、70 %乙醇洗涤即可获得质粒DNA。3. 仪器设备微量取液器（2 L；20 L；200 L；1 000 L），tip头，手掌型离心机，1.5 mL离心管, 恒温水浴，制冰机，超净工作台，恒温培养箱。振荡器，离心机，金属浴，电泳仪，凝胶成像仪。4实验试剂（1）溶液：50 mmol/L葡萄糖；20 mmol/L TrisHCl（pH = 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH=8.0），高压蒸汽灭菌（121 ，0.105 Mpa）20 min。4 贮存。（2）溶液（现用现配）：0.2 mol/L NaOH；1 g / L SDS。（3）溶液（pH 4.8）：每100 mL溶液中含5 mol/L乙酸钾60 mL；冰乙酸11.5 mL；H2O 28.5 mL。（4）RNase（10 mg / mL），LB液体培养基，氨苄青霉素，异丙醇，70 %（V / V）乙醇，无菌水。5. 实验方法（1）分装3 mL LB液体培养基和3 L氨苄青霉素（50 mg/mL）于15 mL玻璃试管中。（2）用灭菌牙签挑取一白色单克隆，放入玻璃管内，置37 恒温摇床中以200转/min培养，至OD600=2.0。（3）取菌液1.0 mL于1.5 mL的Eppendorf 管中，将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ，转速3 500 g，离心5 min，收集细菌。弃上清，倒置于吸水纸上，沥干残液。（4）每离心管中加入冰上预冷的溶液 200 L，置振荡器上剧烈震荡，悬浮菌体。（5）加入新配制的溶液 400 L，翻转10次。冰上放置。（6）冰浴3 min内迅速加入300 L溶液，温和翻转10次，冰浴10 min。（7）将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ，转速12 000 g，离心5 min。取上清液于新管中，同时加入Rnase（10 mg/mL）10 L，混匀，37 保温2 hr。（8）加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），置摇床上震荡5 min，将离心管放入冷冻离心机，调温至4，转速12000 g，离心10min。 （9）取上清液于新的离心管内，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），摇床震荡5 min。（10）将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ，转速12 000 g，离心10 min。取上清，加入等体积异丙醇，迅速翻转5次，冰上放置10 min。（11）将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ，转速12 000 g，离心10 min。弃上清，倒置于吸水纸上。加入500 L 70 %的乙醇轻振，洗涤沉淀。（12）将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ，转速12 000 g，离心10 min。弃上清，室温干燥沉淀30 min。（13）加入20 L无菌水溶解DNA，电泳检测。质粒DNA电泳图6. 实验结果7. 提取质粒DNA过程中应该注意的问题（1）细菌细胞的裂解是分离质粒DNA的关键步骤。通常可以加入溶菌酶或SDS促使大肠杆菌细胞裂解。如果细菌细胞没有完全裂解，会明显降低质粒DNA的回收率。理想的状况是每一个细菌细胞都能够被充分破裂使质粒DNA顺利溢出，而又没有污染过多的染色体分子。（2）质粒提取过程中，除规定的实验条件外，应尽量保持低温，避免过酸过碱，操作过程中手法要温和，尽可能避免脱氧核糖核酸酶（DNase）对质粒DNA的降解和破坏。（3）电泳时上样孔中如果有白色物质，是由于蛋白质没有去除干净。（4）质粒共有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA）：质粒的两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；开环DNA（ocDNA）：质粒的两条多核苷酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一或数个缺口，即OC构型；线性分子（l DNA）：质粒DNA经过适当的核酸限制内切酶切割之后，发生双链断裂而形成线性DNA分子，通称L构型。相同分子质量质粒的三种构型在正常情况下电泳时，迁移速率分别是：超螺旋DNA比线性的DNA迁移率大，线性DNA比开环DNA迁移率大。8. 作业（1）按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验用品及药品、实验步骤等，要详细阐述质粒提取的基本原理。（2）提取质粒DNA过程中应该注意的问题是什么？（3）质粒DNA的三种构型及在正常电泳条件下的迁移情况如何？实验五 动物组织总RNA的分离一 实验目的核酸是生物遗传的物质基础，决定生物体的遗传、变异、生长和发育。在基因工程中，核酸分子是主要的研究对象，因此核酸的分离、提取是分子生物学研究中很重要的技术。RNA是用来在转录水平上研究基因的表达与调控机制的载体，它是基因操作的重要对象，纯度高、浓度高、完整性好的RNA为基因的下游操作可以提供良好的保证，RNA的提取是基因工程操作中最常用、最基本的实验技术。RNA的提取对分子生物学的研究至关重要。纯度高、完整性好的RNA可以用于Northern杂交、mRNA纯化、cDNA文库的构建和体外翻译、RT-PCR等。RNA主要存在于细胞质中，约占75，另外10在胞核中，15在细胞器中。RNA主要包括3种：rRNA占8085；tRNA占l015；mRNA占15。本实验学习动物组织总RNA的快速提取。通过本实验使学生学习掌握甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的方法和技术。二. 实验原理RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂硫氰酸胍，可以溶解蛋白质、破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNAase，所以RNA从细胞中释放出来时不会被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过苯酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。硫氰酸胍酚氯仿法提出RNA：硫氰酸胍与-巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；硫氰酸胍使蛋白质变性，从而释放RNA。甲醛与谷氨酸残基的单亚氨基基团形成不稳定的碱基配对，这些配对通过阻止链内碱基配对而是RNA维持在变性状态。由于此种配对不稳定且容易被稀释除去，因此只有当甲醛存在于缓冲液或凝胶中时，RNA才能维持在变性状态。变性消除了二级结构的单链RNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率与其大小的对数成正比。有溴化乙锭存在时，电泳后28SrRNA和18SrRNA应当能清楚地在紫外灯下看到，有时能看到一条由tRNA和5SrRNA组成的、较模糊、迁移较快的带。如果RNA没有被降解，28SrRNA的亮度应当是18SrRNA亮度的1.5-2.0倍，且这两条带都没有弥散现象。mRNA是不可见的，除非过量上样。 三实验设备及试剂1. 实验设备移液器，tip头， tip头盒、台式高速离心机，研钵，1.5ml离心管 ，三角瓶，磁力搅拌器，试剂瓶，-80冰箱，水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，50ml三角瓶2. 实验试剂RNA提取液： 0.8mol/L盐酸胍，0.4mol/L硫氢酸铵，0.1mol/L醋酸钠（pH5.0），5%甘油，38%Tris-饱和酚。10MOPS缓冲液（吗啉代丙烷磺酸，2-(N-morpholino )propane sulfonic acid）：0.2mol/LMOPS，50mmol/L醋酸钠，10mmol/LEDTA。RNA上样缓冲液：62.5% 去离子甲酰胺，16% 10MOPS，22%甲醛。电泳缓冲液：用无菌水稀释10MOPS，使终浓度为1MOPS。其他试剂：琼脂糖，1mg/ml溴乙锭，溴酚蓝，甲醛，-巯基乙醇，氯仿，异戊醇，75%乙醇，1.2MNaCl，异丙醇，灭菌的ddH2O。四. 实验步骤（1）于1.5ml Eppendorf管中加入1ml RNA抽提液、30l -巯基乙醇。（2）用液氮预冷研钵及三角瓶、钥勺，将直根皮放入预冷研钵后，加入液氮，迅速冷冻后快速研磨至粉末状。（3）迅速用钥勺加粉末于抽提液中，剧烈震荡混匀10分钟。（4）加入350l氯仿/异戊醇，剧烈震荡混匀5分钟。4、12000rpm离心15min。（5）取上清液于一新管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，剧烈震荡混匀10分钟。4、12000rpm离心10min。（6）取上清液于一新管中，加入300l 1.2M NaCl、等体积异丙醇，混匀室温放置10min。（7）4、12000rpm离心10min，弃上清，75%酒精洗沉淀， 4、12000rpm离心5min。弃上清，空气干燥10-20 min，加20 l无菌水溶解沉淀。（8）用透明胶带将胶板的两端封好。（9）电泳胶的制备试剂用量 琼脂糖(0.8%)0.16 g10MOPS4.8 ml水15.2ml（10）倒胶：在距底板0.5-1.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中（注意不要出现气泡），凝胶厚度在3-5 mm之间。（11）RNA样品变性：在1.5ml灭菌离心管中加入3.2 ml上样缓冲液，1.3 mlRNA样品，混合震荡，使之充分混匀，手掌离心机离心10s。65金属浴5 min ，冰上冷却后，手掌离心机离心10s。 （12）在凝胶完全凝固后（室温下30-40 min），撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1MOPS的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面约1 mm。电泳槽中的缓冲液最好与制胶所用的缓冲液是同一批次的，若两种缓冲液中的离子强度及pH不一致，将影响核酸的迁移率。（13）点样：将冷却的变性RNA样品与1 ml溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物加入上样孔中。（14）盖上电泳槽并通电，使RNA向阳极（红线）移动。采用65V电压进行电泳。小电泳槽V=50-65v；中电泳槽V=100v；大电泳槽V=150v。 （15）当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约半小时），切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。五. 作业（1）按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验材料、实验用品及药品、实验步骤。（2）如何避免或减少RNA的降解？六. 实验结果：七注意事项1.创造无RNase的环境：（1）避免手、唾液的污染：戴口罩、手套，并经常更换（使用一次性手套）。（2）空气中的细菌等微生物：在超净台中操作，工作区域应与进行普通微生物实验的区域分隔开来，特别是那些用于细菌接种、培养基和试剂配制的区域，这些区域富含RNA酶。（3）玻璃器皿的处理：用水清洗干净后，200干烤4小时。（4）塑料用品的处理：尽量使用一次性塑料制品，并高压灭菌。（5）RNA电泳槽的处理：需用去污剂洗涤，用水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于H2O2溶液中10分钟后，用0.1 DEPC处理过的水彻底冲洗。（6）降低RNase活性：尽量在冰浴中操作。2.去除内源RNase的污染：（1）在细胞破碎的同时，RNase也被释放出来，原则上应尽可能早地去除细胞内蛋白并加入RNase抑制剂。（2）去除蛋白质的试剂：由于RNase为一种蛋白质，故去除蛋白质的试剂可非特异地抑制RNase的活性。如酚、氯仿，其作用是使蛋白质与核酸解离，同时作为蛋白质变性剂，可以抑制RNase的活性；并且酚与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制；蛋白酶K，与1%2%的SDS合用其效果更佳；阴离子去污剂，常用的有SDS、十二烷基肌氨酸钠等，可以解聚核酸与蛋白质的结合，并且与蛋白质带正电荷的侧链结合，在高盐存在下形成SDS-蛋白质复合物而沉淀。（3）解偶剂（胍类）：盐酸胍、异硫氰酸胍。目前认为，异硫氰酸胍是一种RNase最有效的抑制剂。制备RNA时，如果缓冲液中含有异硫氰酸胍，则可在破碎细胞的同时也使RNase失活。异硫氰酸胍有破坏细胞结构、使核酸从核蛋白中解离出来，并对RNase有强烈的变性作用。异硫氰酸胍与-巯基乙醇（破坏蛋白质的二硫键）合用，使RNase被极度抑制。 （4）低特异性的RNase抑制剂：DEPC：是很强的核酸酶抑制剂，与蛋白质中的组氨酸的咪唑环结合，使蛋白质变性。因此，凡是不能用高温烘烤的材料皆可用DEPC处理（0.1溶液浸泡过夜*，然后再用蒸馏水冲净。试剂亦可用DEPC处理，再煮沸l 5分钟或高压以除去残存的DEPC。否则，如不除尽DEPC，它能使嘌呤羟甲基化从而破坏mRNA的活性。另外，注意配制含有Tris的试剂不能用DEPC处理，因为DEFC在Tris中迅速分解。注意：DEPC可能是致癌物，应小心操作。（5）RNase特异抑制剂：RNase 阻抑蛋白质（RNasin）：它与RNA酶紧密结合，使其失活。与l mmolL -巯基乙醇合用，能发挥最大抑制作用。但不应使用已多次冻融或在氧化条件下保存的抑制剂，因为这会使蛋白质变性，使被结合的RNA酶释放出来。贮存：存放于50的甘油或5 mmolL -巯基乙醇中，-20保存。反复冻融，RNasin极易被破坏。实验六 反转录反应一实验目的：掌握反转录的基本原理和方法。反转录也称逆转录，是某些生物（如鸡的肉瘤病毒、HIV等）的特殊复制方式。它们的遗传信息载体是RNA 而不是DNA。因此，在感染细胞时，首先经过逆转录作用成为双链DNA，才能整合到宿主基因组中去。这个过程由逆转录酶催化，它具有以RNA为模板合成DNA。 逆转录现象和逆转录酶是分子生物学研究中的重大发现，是对经典中心法则重要补充。二 实验药品 模板RNAdNTP随机引物反转录酶AMV或M-MLV5bufferRnase Inhibitor 三实验步骤（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5g，补充适量的DEPC H2O使总体积达11l。在管中加10M Oligo（dT）12-18 1l，轻轻混匀、离心。（2）70加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 然后加入下列试剂的混合物： 10PCR buffer 2l 25mM MgCl2 2l 10mM dNTPmix 1l 0.1M DTT 2l 轻轻混匀，离心。42孵育2-5min。（3）加入Superscript1l ，在42水浴中孵育50min。（4）于70加热15min以终止反应。（5）将管插入冰中，加入RNase H 1l ，37孵育20min，降解残留的RNA。-20保存备用。四注意事项 1.逆转录时所用器具均应在1DECP水中避光浸泡过夜，再高压烘干2.DECP水配制（先加DEPC，再加水，避光过夜，然后高压）3.逆转录时应全程佩戴一次性手套和口罩 4.防止污染 5加样准确实验七 核酸的定量分析 【 实验目的 】 1 掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的方法。 2 熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。 【 实验原理 】 核酸分子中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之一即可推算出核酸含量。 1 定糖法 通过测定 DNA 或 RNA 分子中戊糖的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。 RNA 在强酸环境中加热可水解产生核糖。核糖在浓酸作用下脱水形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - 二羟基甲苯（地衣酚）缩合成绿色化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最大吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进行比色即可测定出 RNA 的含量。 DNA 在强酸环境中加热水解生成的脱氧核糖与浓酸共热脱水生成 - 羟基 - 酮基戊醛，后者与能与二苯胺反应生成蓝色化合物（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进行比色即可测定出 DNA 的含量。 2 定磷法 通过测定核酸中磷的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。 核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.59% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸、 -1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，立即被还原为蓝色的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为 660nm 。当无机磷浓度在 2.525g/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正比。本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中无机磷的含量，将测得的总磷量减去原无机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进而计算核酸的含量。 3 紫外吸收法 核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最大吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。核酸在 260nm 的吸光度值与其浓度在一定范围内成正比关系，这是进行定量分析的依据。为了消除样品中核酸以外的小分子物质和核苷、核苷酸或低聚多核苷酸的影响，测定时需加过氯酸 - 钼酸铵沉淀剂，沉淀除去核酸，测定上清液 260nm 处吸光度值作为对照。将样品的吸光度值减去上清液的吸光度值即为样品核酸的吸光度值。在 260nm 波长下， 1g/ml 的 DNA 溶液的吸光度为 0.020 ， 1g/ml 的 RNA 溶液的吸光度为 0.022 ，以此为标准，根据所测得样品的吸光度值即可计算出溶液中核酸的含量。 【 实验器材 】 1 试管和吸量管 2 微量移液器 3 电炉和烧杯 4. 分光光度计 5 离心机和离心管 【 实验试剂 】 1 5mol/L 硫酸 2 过氧化氢 3 RNA 标准液（ 40 /ml ） 称 RNA40mg ，加 0.1mol/L NaOH 数滴使其溶解，加水到 1 000ml 。 4 DNA 标准液（ 400 /ml ） 称 DNA40mg ，加 0.1mol/LNaOH 数滴使其溶解，加水到 100ml 。 5 3,5- 二羟甲苯试剂 预先将 3,5- 二羟甲苯在笨中重结晶 1 2 次，用活性炭脱色，干燥后备用。取 3,5- 二羟甲苯 0.1g ，加浓盐酸 100ml 使溶解，再加入二水合氯化铜（ CuCl 2 2H 2 O ） 0.15g 使溶解，混合即可。 6 二苯胺试剂 取用 70% 乙醇重结晶的二苯胺 1.0g 溶于 100ml 冰醋酸中，然后再加浓硫酸（保证试剂） 2.75ml 混匀。此二苯胺试剂见光变绿色，需临用前配制，贮于棕色瓶放入冰箱内保存。 7 微量定磷试剂 6mol/L 磷酸：蒸馏水： 2.5% 钼酸铵： 10% 抗坏血酸 1 ： 2 ： 1 ： 1 （ V/V ）。此试剂当天配制，应为黄色或浅绿色，如果呈棕色或深黄色则不能使用。 8 标准无机磷溶液 用 110 恒重的 KH 2 PO 4 配制 100 磷 /ml 的贮存液，使用前稀释成 10 磷 /ml 。 9 过氯酸 - 钼酸铵沉淀剂 70% 过氯酸 14ml ，加钼酸铵 1.0g ，加水 386ml 。 10 核酸样品液（ 10mg/ml ） 称粗制核酸样品 1g ，加 0.1mol/LNaOH 数滴使其溶解，加水到 100ml 。或者，取本教材实验十从动物组织中提取出的核酸样品作为本次实验的样品液。 【 实验操作 】 1 定糖法 （ 1 ） RNA 的定量：取三支试管，标号，按下表操作。 试剂（ ml ） 测定管 标准管 空白管 样品液 0.1 - - 蒸馏水 1.9 2.0 标准 RNA 2.0 3,5- 二羟甲苯 4.0 4.0 4.0 将各管混匀，放入沸水浴中加热 25min ，冷却后于 670nm 测定其吸光度值。 样品液中 RNA 含量的计算公式如下： 样品液中 RNA 含量（ /ml ） （ 2 ） DNA 的定量：取三支试管，标号，按下表操作。 试剂 (ml) 测定管 标准管 空白管 样品液 2.0 - - 蒸馏水 - - 2.0 标准 DNA - 2.0 - 二苯胺 4.0 4.0 4.0 将各管混匀，放入沸水浴中加热 15min ，冷却后于 595nm 测定其吸光度值。 样品液中 DNA 含量的计算公式如下： 样品液中 DNA 含量（ /ml ） 2 定磷法 （ 1 ）总磷测定 消化：取样品 1ml （ 0.2 10mg 核酸）注入微量凯氏烧瓶中，加 5mol/L 硫酸 2.5ml, 加热到发白烟，溶液变为棕黄色时，放下冷至室温，加入过氧化氢 0.1ml （约 2 滴），继续加热至溶液透明为止。冷却至室温，用蒸馏水稀释至 50ml 。 显色：取试管三支，标号，其中两支各加入消化液 3ml ，另一支加入蒸馏水 3ml 作空白，然后加入定磷试剂 3ml ，摇匀，于 45 C 水浴中保温 25min 。 比色：用上述显色液在 660nm 处测定吸光度。 （ 2 ）无机磷的测定：取样品 3ml ，加过氯酸 - 钼酸铵沉淀剂 3ml ，摇匀，放置 30min ，离心，取上清液，用上述同样的方法进行显色和比色。 （ 3 ）无机磷标准曲线的绘制：取 6 支试管，标号，按下表操作： 试剂（ ml ） 1 2 3 4 5 6 标准无机磷溶液 10 /ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 定磷试剂 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 磷含量（ ） 0 2 4 6 8 10 混匀各管试剂，在 660nm 波长下测定吸光度值，以各管含磷量为横坐标，吸光度值为纵坐标，作出标准曲线。 （ 4 ）计算：根据总磷和无机磷的吸光度值，由标准曲线即可查出样品中总磷量和无机磷量，然后可根据下式计算出样品中核酸含量。总磷量等于由吸光度值在标准曲线上查得的磷微 g 数乘以 50/3 ，无机磷量等于由吸光度值查得的磷微 g 数除以 3 。样品液中核酸含量的计算公式如下： 样品液中有机磷含量（ g /ml ）总磷量无机磷量 样品液中核酸含量（ g/ml ）有机磷含量 11.45 式中， 11.45 为换算系数，表示 1g 磷相当于 11.45g 核酸。 3 紫外吸收法 （ 1 ）原液的制备：取样品液 1ml ，稀释至 100ml ，此为原液。 （ 2 ） A 液的制备：取原液 2ml ，再稀释至 50ml ，此为 A 液。 （ 3 ） B 液的制备：另取原液 4ml ，加过氯酸 - 钼酸铵沉淀剂 1ml ，摇匀后置冰箱中 20 分钟，离心 10 分钟， 3 000r/min ，取上清液， 2.5ml 稀释至 50ml ，此为 B 液。 （ 4 ）比色：将 A 液和 B 液分别于 260nm 波长处比色测定其吸光度 a 和 b 。 a b 即为样品核酸的吸光度。 （ 5 ）计算：样品液中核酸含量的计算公式如下： DNA 含量（ g/ml ） RNA 含量（ g% ） 式中， 0.020 表示 1g /ml 的 DNA 溶液测定的吸光度值； 0.022 表示 1g /ml 的 RNA 溶液测定的吸光度值； 2500 为稀释倍数。 【注意事项】 1 市售商品 RNA 及 DNA 不纯，因此欲配制标准液之前，需用定磷法求出其中磷含量，以推算出实际含量。 2 蛋白质对 RNA 和 DNA 的测定均有干扰，因此，在样品蛋白质含量高时，应预先用 5% 三氯醋酸将蛋白质除去，制备成无蛋白质滤液后再测定。 3 以定糖法定量时， 应尽量避免其它糖类及其衍生物和醛类化合物对定糖测定的干扰。 DNA 对 RNA 的测定有干扰，在用 Cu 2+ 作催化剂时，同时有减少 DNA 干扰的作用，改良地衣酚法即用 CuCl 2 作催化剂。 4 以定磷法定量时， 核酸样品应彻底消化，是有机磷完全转化为无机磷。消化不彻底可以使结果偏低。 溶液中的维生素 C 已被空气中的氧氧化，应储存于冰箱中，使用前应检查是否失效。 定磷试剂应当日配制。 5 以紫外吸收法定量时， 样品溶液加入沉淀剂沉淀核酸时，应在冰浴中保持，以避免核酸的降解，因为核酸降解后有增色效应。 要用石英比色杯，石英比色杯可以透过紫外线。 【思考题】 1 定糖法测定 RNA 和 DNA 含量的实验原理有哪些异同？用 CuCl 2 作催化剂比用 FeCl 3 催化剂有哪些优点？ 2 定磷法测定 RNA 和 DNA 含量时，核酸在消化过程中发生了哪些化学变化？定磷试剂的主要成分有哪些？它们的作用是什么？ 3 紫外吸收法测定 RNA 和 DNA 含量时，为什么要用石英比色杯？核酸溶液能吸收紫外光的原因是什么？实验九 感受态细胞的制备与转化1. 实验目的大肠杆菌在特殊的试剂的处理下，可以处于感受态，易于接受外源DNA。经过热激和冷冻可以增加大肠杆菌细胞膜的通透性，便于重组质粒DNA进入大肠杆菌。可以利用蓝白斑进行筛选，白斑是含有重组质粒的大肠杆菌菌落。可以通过质粒的提取和进一步的实验进行验证。通过此实验学习大肠杆菌感受态细胞的制备和转化的基本实验步骤和实验原理，知道通过转化可以鉴定连接的效率。2. 实验原理受体菌在低温下(0 )被置于低渗的CaCl2溶液中，细菌在低渗环境中菌体膨胀成球形。转化体系中的DNA与Ca 2+形成羟基钙磷酸复合物黏附于细胞表面，之后使细菌经42 短时间热冲击处理(热休克)，此时受体菌可大量吸收其表面黏附的DNA复合物，完成转化。继而在培养基上生长一定时间(数小时)后，菌体恢复原状，并可以分裂增殖。由于载体上含有氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因的部分片段，所以可以利用抗性和蓝白斑进行含有重组质粒的大肠杆菌菌落的筛选。3. 实验设备移液器，tip头， tip头盒，手掌型离心机，1.5 mL离心管 , 恒温水浴，制冰机，恒温摇床，超净工作台，恒温培养箱。4. 实验试剂感受态细胞；SOC培养基：在SOB培养基的基础上加入一定量的Mgcl2和葡萄糖。LB固体培养基X-gal：4 %，用DMF溶解。避光冷冻保存。IPTG：0.1mol/L，过滤除菌。避光冷冻保存。氨苄青霉素：使用浓度为50 mg/mL。5. 实验方法感受态细胞的制备（1）制备LB固体培养基平板，划线培养JM109菌。（2）取一单菌落，加到3 mL LB液体培养基中。（3）37 ，200 rpm培养至OD600=0.5-0.6。（4）取0.5 mL菌液加到含有50 mL LB液的三角瓶中。（5）37 ，200 rpm培养至OD600= 0.5-0.6。 （6）将菌液转移到50 mL离心管中，冰上10 min，使菌液冷却。 （7）4 ，2 000 rpm离心5 min。弃上清，沥干菌液1 min，加预冷的CaCl2溶液25 mL，轻晃悬浮菌体，冰上放置10 min。（8）4 ，2 000 rpm离心10 min，弃上清，沥干菌液1 min。（9）加预冷的CaCl2溶液2 mL，轻晃悬浮菌体，冰上放置30 min。（10）分装，每次用200 L。转化（1）从-80 冰箱中取出感受态细胞放于冰上，使其缓慢融化。（2）分装感受态细胞，每个小管30 L。分别加入连接产物3 L，轻轻混匀，冰上30分钟。（3）42 1分钟。（4）冰上2.5分钟，加入SOC培养基470 L。（5）37 摇床摇动1小时。（6）LB固体培养基灭菌后，自然凉至60 时，加入氨苄青霉素（终浓度是50 g/mL）,倒平板。（7）等到培养基凝固后，在其上涂X-gal和IPTG的混合物（两种物质各30 L，在离心管中混合好后取60 L混合物涂扳)。培养皿旋转，转动涂棒涂菌火焰消毒涂棒37倒置培养涂棒菌液平板涂布示意图70 %乙醇（8）液体全干后，将平板过夜、倒置培养于37 恒温箱中。（9）第二天早上观察培养结果。6. 实验结果与分析（1）转化效率偏低，平板上只有少数的蓝白菌落出现：应该考虑的影响因素包括感受态的质量，转化的具体条件的优化。（2）转化平板上蓝斑过多：出现这种现象的原因是连接产物的质量偏低，绝大多数的外源DNA是T-载体而重组质粒的含量过低。（3）转化的平板上没有蓝斑：可能的问题出在X-gal和IPTG的质量上。（4）连接的质量可以通过转化的结果来鉴定。7. 作业（1）按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验用品及药品、实验步骤等，要详细阐述细菌转化的基本原理。（2）试分析转化过程中有可能出现的各种情况（菌落少，蓝斑多，没有蓝斑）。实验十 目的基因与载体的连接与转化1、实验目的掌握目的基因的重组连接原理及方法熟悉重组DNA分子转化受体细胞的基本思路和方法2、实验原理1. DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3末端添加一个或者几个