发酵过程中染菌的有效控制及预防.doc

发酵过程中染菌的有效控制及预防邢攀科摘要：针对微生物发酵过程中的染菌现象，分析了导致发酵染菌的几种主要原因，并提出了有效控制方法，以预防为主，及时观察分析，杜绝发酵染菌的隐患。关键词：发酵 染菌 微生物发酵前言：杂菌感染，简称染菌，普遍存在于微生物发酵工业生产中。特别是夏季，随着气温的不断升高在丙酮、醇粮食发酵法工业生产中尤其突出5。发酵过程是利用某种特定的微生物在一定的环境中进行新陈代谢，从而获得某种产品。现代发酵工业要求纯种培养，不仅斜面、种子和培养基以及发酵罐、管道等须经严格灭菌除去各种杂菌，而且在需氧发酵中通入的空气也需经过除菌处理。只有这样，才能确保生产不受杂菌污染，从而保证生产菌的旺盛生长。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者导致倒罐，甚至停产。工业发酵中污染杂菌造成的损失是十分惊人的，所以必须认真对待除菌。1 发酵过程对设备的要求1.1发酵罐发酵罐在使用之前，需要进行认真检查，以消除染菌隐患，如搅拌系统转动有无异常;机械密封是否严密:罐内的螺丝是否松动;罐内的管道有无堵塞;夹层或罐内盘管是否泄漏;罐体连接阀门严密度等等。机械密封目前在发酵罐上得到广泛应用，取代了以前搅拌轴采用的填料密封形式，但是由于安装精度不高或选用的机械密封不合适，仍然会由于轴封泄露造成染菌，因此在安装搅拌轴时要注意对中， 为了便于观察罐内发酵情况，在人型发酵罐内一般设置有冲洗视镜的蒸汽管道，但是蒸汽一旦冷凝在管道中，冷凝水并不能完全保证无菌，因此冲洗视镜的蒸汽管道要去除，杜绝染菌隐患。如果罐内雾气大看小清楚，可以采用更高亮度的视镜灯6。1.2发酵罐附属设备发酵罐附属设备有空气净化系统，温度、压力流量等控制系统及相应的管道阀门。哪一个环节出问题都会造成发酵失败3。1.2.1空气净化系统传统的空气净化使用活性炭、棉花、超细玻璃纤维纸做过滤器Ul，过滤效果差，操作复杂。目前国内的膜过滤技术比较成熟，用偏二氟乙烯(PVDF)制成的折叠微孔滤膜滤芯，过滤精度高，流量大。使用时只要注意过滤器前压缩空气除湿脱油，并按规范对过滤器灭菌，空气保证无菌还足没有问题的。而且PVDF膜对压缩空气中的水分不敏感，膜本身的疏水性强，使用中注意过滤器排水，解决了以前当空气湿度过大导致棉花过滤器不能使用的问题3。1.2.2温度、压力流量等控制系统 发酵罐实消是对发酵培养基进行彻底的灭菌处理，利用高温过饱和蒸汽的强穿透能力使各种细菌、真菌蛋白质凝固而死亡。在工业灭菌中，对预热时间、蒸汽阀门的开度、灭菌温度、灭菌压力和泡沫控制等，都有严格要求，一个环节出现问题，就容易导致染菌。一般工业上灭菌温度在1100C，灭菌压力O.SMPa以上，而保证灭菌温度和压力准确的就是各种温度探头、压力传感器。因此定期对这类探头、传感器、电极的检定十分重要3。1.2.3阀门阀门对介质的密封性可分为4级3，公称级、低漏级、蒸汽级和原子级。公称级与低漏级密封适用于关闭要求不严密的阀门，例如用于控制流量的阀门。蒸汽级密封适用于蒸汽和大部分其他工业用阀门的阀座、阀杆和阀体连接部的密封。原子级密封适用于介质密封性要求极高的场合，如宇宙飞船和原子能动力设备等。发酵工业中由于使用高温蒸汽对发酵设备进行灭菌，因此阀门要求是蒸汽级密封。阀门在发酵设备中使用最多，用的阀门也有各种型号，考虑到阀门使用范围和易于维护，发酵工业上使用最多的是截止阀。近年来国内已开发发酵专用阀门，效果较为理想，如条件许可，也可选用。2 发酵过程对空气的要求采用空气净化设备系统制备无菌空气，要严格控制好下述两点：一是提高空气进入压缩机之前的洁净度，二是除尽压缩空气中夹带的油水。否则会影响无菌空气质量1。2.1空气过滤器 工业用的空气除菌系统中的空气过滤器一般都比较庞大，如果其中的纤维铺设不匀，密的部分阻力大，松的部分阻力小，就会使较多的空气沿着阻力小的部分流出，从而形成短路。走短路的那部分空气没有经过充分过滤而带菌，进入发酵罐将使发酵染菌。纤维层装得太松对过滤不利，太紧同样也会影响过滤效率。同时，在过滤介质用蒸汽灭菌时，太紧则蒸汽穿透力差，穿透力差灭菌效果也差。所以用过分压实纤维层的办法试图达到增加过滤效率的目的，实际上是适得其反。对于棉花过滤器最合适的充填密度是160 180公斤米3；玻璃纤维是130 180公斤米3左右。在铺纤维时分层均匀铺设是必要的。 过滤器器壁腐蚀形成氧化铁层，氧化铁是一种多孔物质，空气会在其中穿过而得不到过滤，因而也会使空气中带茵并造成污染。 采用活性炭棉花作为过滤介质的空气过滤器，活性炭受到气流的冲击互相碰撞、摩擦而破碎并逐渐灰化，使活性炭的体积减小空间增大，上下两端的棉花受空气的顶撞力而逐渐改变位置。之后，灰化的活性炭随气流逸出，整个过滤介质的体积减小使过滤层倾斜甚至发生翻身的现象，致使大量未经过滤的空气进入发酵罐内造成严重的染菌事故。在用蒸汽灭菌时，检查排出蒸汽的情况可以判断过滤层是否有问题。排出蒸汽均匀并呈青色有力表示情况良好，排出蒸汽呈雾状无力表明压得太紧，而当排出蒸汽断续不均匀以及进出口两测的压力降过小时则就有可能是过滤层有位移现象，发现不正常的情况应立即予以纠正。 大多数产品在整个发酵期间需要改变空气流量，但油水分离设备、过滤器的过滤面积和长度是根据空气流速来设计的，空气流速的改变就会影响油水分离效果和过滤效率，所以设计时要充分注意这种情况，掌握空气流量改变的范围，选择合适的空气流速。生产时各罐的发酵时间要尽量叉开，使空气流量均匀。2.2 检查介质是否失效首要原因是油水分离系统效果不佳，油水分离不完全，进入总过滤器的空气相对湿度远高于50 60 ，使棉花活性炭过滤器和超纤维过滤器的过滤介质受潮而失效，这时应分别检查冷却、分离和加热效果， 确定原因。当然空气系统所有的设备必须定时打开排污阀排去油水， 否则若设备内积污液太多也会使介质受湖，应落实制度定时排污。另外，过滤器的蒸汽阀门漏，也会使介质受潮，应检查。第二种原因是总过滤器的棉花活性炭翻身，空气走短路，过滤器没有起到应有静过滤作用，杂菌没有滤除，而进入发酵罐与种子罐， 导致染菌。第三种愿因是遏到染菌，拆装过滤器后，把棉花介质压得太紧，这样，虽然过滤效果好，但因介质太紧，使蒸汽穿透困难， 导致过滤器灭菌不透而染菌。这种情形可根据正常使用时，过滤器前后的空气压差来判断，若压差大，说明介质装填太紧。具体装置可根据计算确定 怀疑空气系统染菌时，既要检查油水分离情况，又应拆装过滤器。若是新建工厂出现大批连续染菌，如确定是空气染菌，有可能是设计问题，这时应根据发酵规模及环境污染程度， 更改设计的过滤器内空气线速度，提高其分离效率。3 种子带菌的防止 种子带菌的的主要原因有以下几方面：一是培养基及其用具的灭菌不彻底，二是菌种在保藏和培养过程中染菌，三是在移接过程染菌。因此应对培养基、培养菌种所用的工具进行充分灭菌；同时对培养环境、菌种保藏环境和无菌室进行充分的灭菌；另外就是在菌种的移接过程中应严格按照无菌操作进行4。3.1无菌室 接种、移种等无菌操作需要在无菌室内进行。无菌室面积一般6m2（长3m，宽2m，高2m）2。为了减少外界空气的侵入，无菌室要有1 3个套间(缓冲过道)。无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成圆弧形，便于揩擦清洗以减少空气中微生物的潜伏场所，室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。通常用30瓦紫外线灭菌灯照射20 30分钟即可。紫外线杀菌的效率还与室内空气的性质有关；空气温度高杀菌效率高，空气中灰尘多杀调效率低，而相对湿度高则紫外线灯的使用寿命长。紫外线能穿过石英但不能透过玻璃。 配合使用的化学灭菌药剂有：用作喷洒或揩擦的(以揩擦为主)有75%酒精、0.25%新洁而灭(季胺盐)、0.6 1%漂白粉、0.5%石炭酸、0.5%过氧乙酸、1%煤酚皂(来苏尔)、0.5%高锰酸钾、300单位/毫升土霉素、50单位/毫升制霉菌素等；用作熏蒸的有甲醛(每立方米空间约用10毫升)或硫磺(每立方米空间约用2 3克)。要根据不同情况采用不同的灭菌剂。如检查出无菌室中潜伏的微生物中细菌较多，用石炭酸、土霉素等灭菌较好；如无菌室中霉菌多可以采用制霉菌素；如有噬菌体则用甲醛、双氧水或高锰酸钾等较好。 无菌室内无菌度的要求是：把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的菌落在3个以下为好。 在种子的无菌条件不要求很高的情况下，可以不采用无菌室而直接用无菌箱进行操作，但无菌要求很高的情况下，即使在无菌室内还要用无菌箱操作。 无菌室的利用次数要恰当，每次使用时间也不宜过长。用具要经蒸汽灭菌或用灭菌剂揩擦后才能带入使用。 3.2灭菌锅 灭菌锅是一种压力容器，作为培养种子及小型试验用具的灭菌之用，有立式和卧式两种。灭菌操作时需要注意排气管是否畅通，因为灭菌锅的排气管较小，易被铁锈或瓶子破碎后的培养基等所堵塞。如果排气管不道，锅内空气排不出去形成气团，蒸汽就不易渗入，从而使灭菌不彻底。用某种较耐热的芽抱杆菌进行试验证明：在排气不通畅的情况下，以1公斤/厘米2的蒸汽压力经30分钟灭菌后进行检查，发现某些部位的三角瓶中，灭菌前放入的芽抱杆菌没有被杀死。如果不是采用蒸汽而是用锅内烧水的办法进行灭菌，那末排气的时间更要长一些，不然水蒸汽来不及驱出空气而使被灭菌的瓶中的冷空气排不尽。 3.3摇瓶机 摇瓶机(亦称摇床)是培养好气菌的小型试验设备或作为种子扩大培养之用，常用的摇瓶机有往复式和旋转式两种。往复式摇瓶机的往复频率一般在80 140次分，冲程一般为6 14厘米，如频率过快、冲程过大或瓶内液体装料过多，在摇动时液体要溅到包瓶口的纱布上易引起染菌，特别是启动时更易发生这种情况。 旋转式摇瓶机的偏心距一般在3 6厘米之间，旋转次数为60 300转分。 放在摇瓶机上培养瓶中发酵液所需的氧是由室内空气经瓶口包扎的纱布(一般是八层)或棉塞通入的，所以氧的传递与瓶口的大小，瓶口的几何形状和棉塞或纱布层的厚度和密度有关。在通常情况下，摇瓶的氧吸收系数(亚硫酸氧化值)Kd取决于摇瓶机的特性和三角瓶的装料量。 往复式摇瓶机是利用曲柄原理带动摇床作往复运动，机身为铁制或木制的长方形框子，有一层至三层托盘，托盘上开有圆孔备放培养瓶，孔中凸出一三角形橡皮，用以固定培养瓶并减少瓶的震动，传动机构一般采用二级皮带轮减速，调换调速皮带轮可改变往复频率。偏心轮上开有不同的偏心孔，以便调节偏心距。往复式摇瓶机的频率和偏心距的大小 对氧的吸收有明显的影响。据有关文献报导，当冲程为10厘米、往复频率为200次/分，Kd值可达2.41毫克分子氧/升，分，大气压；当冲程为5厘米、往复频率240次/分时，Kd值可达1.25毫克分子氧/升，分，大气压。 根据支承装置结构不同，往复式摇瓶机分为滚轮式和悬挂式两种。 滚轮式摇瓶机是将摇床置于四个滚轮上，悬挂式摇瓶机是用四条吊杆将摇床吊在机架上，结构较为简单，托盘可装至三层以上，能放5 10升甚至更大的瓶，动力消耗较少。但悬挂式摇瓶机如为多层时，每层的冲程不一样，越是上层冲程越小。故使用多层悬挂式摇瓶机时应予注意。 旋转式摇瓶机是利用旋转的偏心轴使托盘摆动，托盘有一层或两层，可用不锈钢板、铜板、塑料板或木板制造。托盘由三根呈等边三角形分布的偏心轴支承，也有用滚动轴承作支承的。在三个偏心轴上装有螺栓可调节上下，使托盘保持水平。此种摇瓶机结构比较复杂，加工安装要求比往复式高，造价也较贵。其优点是氧的传递较好，功率消耗小，培养基不会溅到瓶口的纱布上。 有关文献报导，采用旋转式摇瓶机，对于300毫升或600毫升的三角瓶，当转数在500转/分和具有各种挡板条件下，与实装培养液10升具有六叶涡轮搅拌器的实验型发酵罐（通风率0.6米vvm；1000转/分)的Kd值一样。所以摇瓶机将成为放大发酵试验过程中的一种更有效的工具。4 染菌后的挽救措施 为了减少损失，对被污染的发酵液要根据具体情况采取不同的挽救措施。 如果种子培养或种子罐中发现污染，则这批种子就不能再继续扩大培养，因为此时的损失毕竟是很小的。 发酵早期染菌可以适当添加营养物质，重新灭菌后再接种发酵。中后期染菌，如果杂菌的生长将影响发酵的正常进行或影响产物的提取时，应该提早放罐。但有些发酵染菌后发酵液中的碳、氮源还较多，如果提早放罐，这些物质会影响后处理提取使产品取不出，此时应先设法使碳、氮源消耗，再放罐提取。 在染菌的发酵液内添加抑菌剂(如小剂量的抗菌素或醛类)用以抑制杂菌的生长也是一种办法。抑菌剂要事先经过试验，确实证明不妨碍生产菌的生长和发酵才能使用。 因而不是所有发酵都能使用抑菌剂。另外，采用加大接种量的办法，使生产菌的生长占绝对优势排挤和压倒杂茵的繁殖，也是一个有效的措施。还有将种子罐中种子培养好后，进行冷冻保压(1.5公斤/厘米2，10左右)，经平板检查证明无杂菌后，再接入发酵罐发酵，这一措施在一些谷氨酸发酵生产工厂取得很好效果。 有时发酵罐偶而染菌，原因一时又找不出，一般可以采取以下措施： (1)连续灭菌系统前的料液贮罐在每年410月份(杂菌较旺盛生长的时间)加入0.2%甲醛，加热至80，存放处理4小时，以减少带入培养液中的杂菌数。 (2)对染菌的罐，在培养液灭菌前先加甲醛进行空消处理。甲醛用量每立方米罐的体积0.120.17升。 (3)对染菌的种子罐可在罐内放水后进行灭菌