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卵巢恶性上皮性肿瘤中HLA【关键词】 卵巢癌摘 要 目的：探讨卵巢癌中HLADR抗原表达和树突细胞浸润的情况及其意义。方法：用免疫组化SP法对卵巢恶性上皮性肿瘤(48例)、良性上皮性肿瘤(30例)及正常卵巢(30例)的HLADR抗原表达及树突细胞浸润情况进行对照研究。结果：正常卵巢组织中HLADR阴性,卵巢恶性上皮性肿瘤中HLADR表达阳性率为52.08(P0.01)；HLADR表达率与肿瘤分化程度相关(P0.01)，且与预后相关(P0.05)；卵巢恶性上皮性肿瘤中树突细胞(S100+DC)浸润显著增加(P0.001)；S100+DC浸润与肿瘤间质淋巴细胞浸润相关(P0.01)；S100+DC浸润与肿瘤患者预后相关(P0.05)。结论：卵巢恶性上皮性肿瘤中HLADR抗原表达增强，树突细胞浸润增加，二者可能是局部抗肿瘤免疫的重要环节；HLADR和树突细胞浸润数量可作为提示卵巢癌患者预后的指标。关键词 卵巢癌;预后;HLA抗原/免疫学;S100蛋白;树突细胞;免疫组织化学XIAO Guohong, CHEN Huizhen,ZHANG Guiqing,ZHENG XiulingSecond Municipal Peoples Hospital,GuangZhou，Guangdong 510150 Abstract Objective:To investigate the clinical and immunological significance of HLADR antigen expression and dendritic cell infiltration in epithelial ovarian cancer. Method: Samples of 108 cases including normal ovarian tissue (n=30),benign (n=30) and malignant epithelial ovarian tumor (n=48) were used in a comparative study. The SP immunohistochemical stain method was used.Result:HLADR antigen positive rate was significantly higher in the malignant group (52.08%) than that in benign group (10%) and in normal group(0%) (P0.01). There was a correlation between the HLADR expression rate and the tumuor differentiation and between HLADR expression and the prognosis. The number of infiltrating dendritic cells (S100+DC) was much higher in malignant(538.17255.01) than that in benign group(345.96226.81) and in normal group (335.15160.32) (P0.01). There was a correlation between the dendritic cell (S100+ DC) infiltration and the intertumour lymphocyte infiltration (P0.01) and the prognosis (P0.05).Conclusion:It was shown that HLADR antigen expression and dendritic cells infiltration in epitherial ovarian cancer increased, which could play a important role in antitumour immunity. The expression of HLADR antigen and the grade of dendritic cells infiltration in epitherial ovarian cancer is the indicator for the prognosis.Key words ovarian cancer;HLADR antigen/immundogy;S100 protein;dendritic cell;prognosis;immunohistochemistry.人类主要组织相容性复合体即HLA(Human Leukcute Antigen),是迄今所发现的最复杂的基因复合体，它分别表达、类抗原分子，HLADR是类抗原中表达最频繁的一种。树突细胞(dendritic cell ,DC)是体内主要的抗原提呈细胞，是T细胞依赖性免疫应答的重要辅助细胞，通常表达S100蛋白，故称为S100+DC。近年来HLA分子及S100+DC在肿瘤细胞免疫中的作用引起了广泛关注，一些学者开始研究HLA分子及S100+DC与肿瘤发生、发展的关系，相关的研究报告已见于胃癌、食道癌、结肠癌等1,2。但尚未见到HLA分子及S100+DC与卵巢癌关系的研究报告。本研究应用免疫组化方法，将卵巢癌与良性上皮性卵巢肿瘤、正常卵巢组织进行对照研究，探讨HLADR分子及S100+DC在卵巢癌中的意义。1 材料和方法1.1 标本来源1.1.1 试验组 收集广州市第二人民医院19901995年间手术切除的上皮性卵巢肿瘤的存档蜡块标本，均经10%中性福尔马林液固定、石蜡包埋。其中恶性肿瘤48例，年龄2570 a，平均48.9 a，所有病例均接受卵巢癌根治术或卵巢癌细胞减灭术。术后给予PC或PAC方案化疗8个周期。手术分期采用FIGO标准，所有病例术后均进行随访，中途失访4例，随访率为91.77%。1.1.2 对照组 收集同期手术切除的正常卵巢组织的存档蜡块标本，共30例。 1.2 主要试剂 一抗系美国Maxim Biotech.Inc.公司生产的即用型单克隆抗体。抗鼠SP免疫组化试剂盒，系美国Zymed . Lab . Inc 公司生产。以上试剂均购自福州迈新生物技术公司。1.3 方法1.3.1 常规HE法染色 对所有标本重新切片，常规HE法染色，由专人阅片，进行病理诊断，并采用微标尺法计数间质淋巴细胞浸润；免疫组化染色方法：SP法。1.3.2 对照 用试剂公司提供的阳性对照片作阳性对照；用PBS代替一抗作阴性对照。1.3.3 染色结果判定 HLADR标记阳性细胞的胞膜，胞浆呈棕色，核无着色。HLADR标记分为阳性、阴性两种结果；S100标记阳性细胞则采用微标尺法计数阳性细胞的个数(个mm2)。1.3.4 统计方法 应用SPSS软件进行2检验、t检验。2 结果2.1 组织形态2.1.1 HLADR表达 HLADR阳性表达表现为上皮细胞的细胞膜染成棕色，细胞浆内呈棕色颗粒，细胞核无着色；同一阳性片中，不同区域的细胞染色强弱不尽相同。2.1.2 S100标记 上皮细胞无着色，间质中可见阳性细胞，细胞膜呈棕色，细胞浆内棕色颗粒，细胞核染成棕色；细胞呈树枝状，嵌于肿瘤细胞之间；与肿瘤细胞，间质浸润淋巴细胞密切接触。2.2 HLADR在正常卵巢组织，良性上皮肿瘤、恶性上皮性肿瘤中的表达情况 正常卵巢组织中HLADR抗原表达均为阴性，30例良性上皮性肿瘤中阳性率为10%；48例卵巢癌中HLADR阳性率为52.08%，见表1。卵巢癌中HLADR表达率显著高于良性肿瘤及正常卵巢组织（P0.01）；而良性肿瘤与正常卵巢组织的HLADR表达率则无明显差别（P0.05）。广东药学院学报(ACAD J GCP) 2000，16(4)第4期 肖国宏等：卵巢恶性上皮性肿瘤中HLADR表达及树突细胞浸润的意义表1 正常卵巢、卵巢良性、恶性上皮性肿瘤的HLADR表达略2.3 HLADR表达与卵巢癌临床病理特征的关系 48例卵巢癌中，浆液性23例，内膜样癌12例，粘液性13例；HLADR表达与各项临床病理参数的关系，见表2。统计学分析显示，不同组织类型、不同分化程度的HLADR表达差异有统计学意义（P0.01），HLADR表达与临床分期有关（P0.05），而与间质淋巴细胞浸润无关（P005），见表3。表2 卵巢癌HLADR表达与临床病理的关系略表3 卵巢癌HLADR表达与间质淋巴细胞浸润的关系 略2.4 HLADR表达与卵巢癌患者预后的关系 HLADR阳性组和阴性组，3年生存率分别为8062%和65.46%，5年生存率分别为50.73%和35.77%，经过生存分析发现，HLADR表达与卵巢癌患者生存相关，HLADR阳性患者预后较好（Logrank检验，P0.05）。2.5 S100+DC在正常卵巢、良性上皮性肿瘤、恶性上皮性肿瘤中的浸润情况 正常卵巢组织，良性上皮性卵巢肿瘤及卵巢癌中均有S100+DC浸润，但在卵巢癌中S100+DC浸润数量多于正常卵巢及良性肿瘤，差异有非常显著性意义（P001），而良性肿瘤与正常卵巢组织则无显著性差异（P0.05）。见表4。表4 S100+DC在正常卵巢及良、恶性肿瘤中的浸润情况略2.6 卵巢癌S100+DC浸润与间质淋巴细胞浸润的关系 卵巢癌间质中淋巴细胞浸润程度，与S100+DC数量呈直线相关(P0.005）。2.7 卵巢癌HLADR表达与S100+DC浸润之间的关系 HLADR阳性组卵巢癌S100+DC浸润细胞数为(598.31296.44) mm2,而HLADR阴性组为(469.73198.57) mm2。HLADR阳性组高于阴性组，差异有统计学意义（P0.05）。2.8 卵巢癌中S100+DC浸润与生存时间的关系 以S100+DC浸润程度将卵巢癌患者分为两组：S 100+DC400者为低度浸润，S100+DC400者为高度浸润；计算生存率，进行生存分析。结果：高度浸润组3年生存率和5年生存率分别为72.65%和60.73%；低度浸润组则分别为6313%和49.98%，两组病人生存期差异有统计学意义（P0.05），S100+DC高度浸润组患者预后好于低度浸润者。2.9 正常卵巢组织，良、恶性卵巢上皮性肿瘤中淋巴细胞浸润情况 卵巢癌癌周间质淋巴细胞浸润数量，较良性肿瘤，正常卵巢组织显著增多（P0.05），而良性肿瘤与正常卵巢组织的淋巴细胞浸润则无显著差异（P0.05）。见表5。表5 正常卵巢及良、恶性卵巢上皮肿瘤中淋巴细胞浸润情况略 3 讨论3.1 HLADR在卵巢肿瘤中的表达及其意义HLADR是HLA类基因所表达的抗原之一。在正常情况下，HLA类抗原仅在少数特定的细胞中表达，如激活的淋巴细胞，巨噬细胞等，上皮组织中不表达。在临床研究中，相继有学者证实，HLA类抗原在肿瘤中出现异常表达。Sumiya等报告HLADR在胃癌中表达率为4242%；杨春康等报告HLADR在结肠癌中表达率为47%；在鼻咽癌、喉癌、乳腺癌等研究中也有报告，,而在卵巢癌中的表达情况尚未见报道。本实验对正常卵巢组织，卵巢良性、恶性上皮性肿瘤进行HLADR表达的对照研究，发现HLADR在恶性肿瘤中的表达率高于正常卵巢组织及良性肿瘤，差异有统计学意义（P0.01）。关于HLADR在肿瘤中异常表达的原因，目前有两种理论：HLADR抗原是细胞失分化的标记，HLADR表达是由于细胞转化过程中，HLA类基因表达与调控发生改变，而使肿瘤细胞获得这一表型，它是与恶性表型同时发生事件。HLADR抗原是肿瘤浸润淋巴细胞释放的淋巴因子所诱导产生的，特别是干扰素（INF）和肿瘤坏死因子（INF）。我们的研究发现在卵巢癌不同的组织类型，不同的分化程度，其HLADR抗原表达率有显著差别;而HLADR表达与肿瘤间质淋巴细胞浸润则无相关性。研究结果倾向于支持第一种理论。对于HLADR的表达与肿瘤的预后方面的研究，国外学者在胃癌、喉癌和乳腺癌的研究表明，HLADR的表达与预后存在正相关，。本研究对48例卵巢癌的HLADR表达进行了研究，阳性率为52.08%，经过寿命表法生存分析，显示HLADR阳性组病人预后较阴性组为好（P005）。说明卵巢癌的HLADR表达也与预后呈正相关。3.2 树突细胞在卵巢癌中的浸润及意义。树突细胞是一类形态不规则、核大且不规则、胞质较少、并向周围发出突起、呈树枝状的细胞。树突细胞有多种分子标记物，S100蛋白就是间质性树突细胞最常用的标记分子。树突细胞是重要的抗原呈递细胞（Antigen presenting cell,APC），具有强大的抗原呈递功能，它不仅能有效地呈递外源性蛋白抗原，而且，对内源性抗原及自身抗原呈递至T细胞的过程也至关重要。如果抗原刺激信号来自树突细胞，即使极低含量的抗原也能诱发T细胞产生免疫应答。因此，树突细胞在细胞介导的抗肿瘤免疫中起启动作用，反映机体免疫系统的抗肿瘤潜能。而机体抗实体肿瘤的免疫反应是以局部细胞免疫为主的。正是因为如此，近年来，树突细胞在机体抗肿瘤免疫方面的作用引起了广泛关注。研究发现S100+DC数量与肿瘤预后有关79。关于卵巢癌中树突细胞的研究尚未见报道。我们用免疫组化方法，研究了卵巢上皮性肿瘤中S100+DC的分布并定量检测S100+DC浸润数量及其与预后的关系，研究表明：卵巢恶性上皮性肿瘤中S100+DC浸润数量显著多于正常卵巢组织及卵巢良性上皮肿瘤（P0.01），并且S100+DC浸润程度与患者预后呈正相关，S100+DC高度浸润患者的预后较好（P0.05）。说明对卵巢恶性上皮性肿瘤，S100+DC有提示预后的价值。3.3 HLADR表达、S100+DC浸润与抗肿瘤免疫的关系。在机体的抗肿瘤免疫中，细胞免疫占有极其重要的主导地位。近年来，大量的免疫学实验研究证实，T细胞不识别游离抗原，只能识别由抗原呈递细胞提交的被加工过的抗原片段即抗原肽，且这一识别受MHC的约束，有辅佐分子的积极参与，具体的识别模式是在T细胞和抗原递呈细胞之间形成一个以T细胞受体(TCR)、抗原肽、MHC为主要成分的三元体，即抗原MHCTCR三分子复合结构。这种识别模式，不仅存在了T细胞与APC之间，还存在于T细胞与之杀伤的靶细胞之间，以及与其它免疫细胞之间的信息沟通过程中。这就是MHC限制的机制。其中CD4+ T细胞只能识别MHC类抗原，而CD4+ T细胞对于诱导免疫记忆，产生长期的抗肿瘤免疫是必不可少的。可见HLA在抗肿瘤免疫中的重要作用。如前所述，我们的研究证实，HLA类抗原在卵巢上皮性恶性肿瘤中异常的增强表达，从机体抗肿瘤免疫的角度来讲，这正好提供了抗肿瘤免疫的分子基础；而HLA类抗原的表达与患者预后呈正相关，也佐证了肿瘤对宿主的免疫系统具有调节作用，HLA类抗原的表达对机体抗肿瘤免疫起正反馈调节，进而对肿瘤的进展起抑制作用。前面已经提到，树突细胞是最有效的抗原递呈细胞，在细胞介导的抗肿瘤免疫中起启动作用，反映机体的免疫系统的抗肿瘤潜能。我们的研究显示，卵巢恶性上皮性肿瘤的间质S100+DC浸润与HLA类抗原表达呈正相关（P0.05）, 而淋巴细胞浸润与S100+DC浸润呈直线相关(P0.05),这与刘思纯等在大肠癌的研究结果一致（8）。说明树突细胞在机体抗肿瘤免疫中起关键作用。由此可见，机体抗肿瘤免疫过程，在抗原水平，有保护性抗原HLA类抗原的表达增强；在APC水平，有树突细胞浸润增加；在效应水平，有淋巴细胞浸润的增加。从而，为我们在基因治疗的策略提供了思路。参考文献1Sumiya Ishigami.Prognositic value of HLADR Expression and dendritic cell infiltration in gastric cancerJ. Oncol,1998,55：65.2Tsajitani S,Kakeji Y,Watanabe A,et al.Infiltration of dendritic cells in relation to tumor invasion an