代谢控制发酵育种的基本技术PPT课件

1 第四章代谢控制发酵育种的基本技术 代谢控制发酵课程 授课教师 张侠 2 要控制微生物的代谢作用 就是要控制培养条件和微生物的遗传型 改变微生物的遗传型往往是控制代谢的最有效途径 方法包括培育有遗传标记的突变株 或将目的产物基因进行克隆而加以扩增 要获得有目的遗传标记的突变株 常采用诱变或细胞内基因重组等育种技术 3 诱变育种 利用物理或化学因素处理微生物细胞群体 促使其中少数细胞中的遗传物质 DNA 的结构发生改变 从而引起微生物的遗传性状发生变化 然后通过目的选择标记设法从群体中筛选出少数性状优良的突变菌株的过程 诱变技术操作简便 收效显著 因此应用非常广泛 是代谢控制发酵育种中最基本的技术 第一节诱变 4 微生物诱变育种的程序 5 一 诱变剂 突变 生物出现与亲代不同的遗传性状的现象 即生物体的表型发生了可遗传的变化 其本质是生物体的遗传物质 DNA或RNA 中的核苷酸序列发生了稳定 可遗传的变化 凡是能够显著地提高突变频率的理化因素均可称为诱变剂 常用的诱变剂可分为物理诱变剂和化学诱变剂 6 物理诱变剂物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤 继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程 物理诱变因素很多 有非电离辐射类的紫外线 激光和离子束等 能够引起电离辐射的X射线 射线和快中子等 近年的新型诱变剂有微波 红外射线 激光 高能电子流等 7 化学诱变剂在选择有效化学诱变剂的工作中 已经试验过几千种化学物质 发现从简单的无机物到复杂的有机物都有许多具有诱变作用的物质 如金属离子 一般化学试剂 生物碱 代谢拮抗物 生长激素 抗菌素 高分子化合物 药剂 农药 灭菌剂 染料等 化学诱变剂都具有毒性 其中90 以上是致癌物质或极毒药品 使用时要格外小心 避免与皮肤直接接触 也要防止污染环境 8 1 紫外线紫外线是一种使用方便且诱变效果较好的物理诱变剂 紫外线的波长为136 390nm 其中波长为260nm的紫外线杀菌能力最强 人工制作的紫外灯发出的253 7nm的紫外线杀菌能力强而且稳定 诱变效果良好 胸腺嘧啶二聚体的形成是紫外线改变DNA分子结构及生物活性的主要途径 紫外线对生物体具有杀菌和诱变双重生物学效应 9 紫外诱变操作 比较简单 在诱变箱内 边进行紫外照射边搅拌细胞悬液即可 注意事项 为了避免光复活作用 照射过程及照射后操作必须在暗处或红光下进行 紫外诱变不受温度影响 可在室温下进行 最好安装稳压电源器 操作时注意防护 皮肤 角膜 10 2 亚硝酸亚硝酸能使碱基氧化脱氨 结果使A H C U G X 从而改变了碱基的配对关系 引起突变 G脱氨后成为X X是一种无意义的碱基 不能同任何一种其它碱基配对 因此 这种变化只能导致细胞死亡 而不能期望它会诱发突变 亚硝酸极不稳定 易分解 易挥发 因此 需要在临用前将NaNO2在pH4 5醋酸缓冲溶液中生成HNO2 诱变后 应用大量水稀释终止亚硝酸作用 11 生物学上的烷化剂是指在正常的生理条件下 能将其烷基转移给重要生物大分子的一类化合物 烷化剂能够与DNA分子的许多部位发生作用 结果使DNA分子增加了烷基侧链 从而改变了DNA的分子结构 这就是烷化剂引起生物体发生突变的主要原因 在烷化剂中最常用的是硫酸二乙酯 DES 和亚硝基胍 NTG 3 烷化剂 12 烷化剂的某些性质 13 14 菌种选育常用的诱变剂 15 16 二 诱变育种中的几个问题 诱变育种工作量大 周期长 对一般周期为7 10d的抗生素菌种来说 一代诱变需要2 3个月 具体要选育怎样的菌种 在诱变育种前 应该对生产的设备和工艺有相当的知识和全面了解 如现有菌种的生产能力 菌种适应情况 现有生产设备结构等 新菌种能否达到缩短周期 发酵低热 降低成本等等 17 诱变育种的主要环节是 以合适的诱变剂处理大量分散的微生物细胞悬浮液 细胞或孢子 在引起绝大多数细胞致死的同时 使存活个体中的变异频率大大提高 设计一种有效的筛选方法淘汰负变株 并把正突变株中少数变异幅度最大的具有优良性状的菌株巧妙地挑选出来 18 1 出发菌株的选择 菌种可以从以下几个途径进行收集和筛选 19 工业上用来诱发变异的菌株 称为出发菌株 出发菌株通常有三种 从自然界分离得到的野生型菌株 对诱变剂敏感 易发生变异 容易产生正突变 由自发突变经筛选得到的菌株 也属于野生型菌株 在生产中使用的 具有一定生产能力 容易收到较好的效果 已经诱变过的菌株 较为复杂 常用回复突变或经基因重组后再作为诱变育种的出发菌株 20 选择易于表现出基因发生改变的单倍体细胞 选择纯种 单核或细胞核尽量少的细胞 在混有野生型和突变型的异核体中 可能出现分离性表型延迟现象 如在霉菌诱变育种中 多采用分生孢子或孢子囊孢子进行诱变处理 选择出发菌株应考虑其稳定性 大幅度提高产量是经过多次诱变 筛选的结果 21 2 菌龄一般处理细菌的营养细胞 采用生长最旺盛的对数期 孢子或菌株要年轻 健壮 其变异率较高且重现性好 霉菌和放线菌一般处理它们的孢子 处理时力求孢子处于活跃状态 即最好采用刚刚成熟时的孢子 其变异率高 如在处理前事先将孢子培养数小时 使其脱离静止状态 则诱变率也会增加 22 一般采用生理状态一致 用选择法或诱导法使微生物同步生长 的单细胞或孢子进行处理 处理前细胞尽可能达到同步生长状态 细胞悬浮液经玻璃珠振荡打散 并用脱脂棉或滤纸过滤 以达到单细胞状态 对于酵母等个体较大的细胞 可换用二层擦镜纸过滤 经此处理 分散度可达90 以上 供诱变处理较为合适 霉菌和放线菌采用孢子悬浮液进行诱变 3 菌悬液的制备 23 根据选用的诱变剂不同 菌悬液可用生理盐水或缓冲液配制 用物理诱变剂处理时 一般用生理盐水 NaCl0 85 配制悬浮液即可 用化学诱变剂处理时 必须采用缓冲溶液 24 4 菌悬液的浓度一般处理真菌的孢子或酵母时 其悬浮液的浓度大约为106个 ml 细菌和放线菌孢子的浓度大约为108个 ml 悬浮液中的细胞可采用平板活菌计数法 光密度法 OD值 血球计数法 酵母菌和真菌的孢子 和电子计数器法测定 由于总菌数与活菌数间差异很大 所以最好以测定活菌数为标准 25 5 前培养处理前将细胞培养在补给了嘌呤 嘧啶等碱基或酵母膏培养基中20 60min 再进行诱变处理 则变异率可大幅度地提高 26 前培养 27 6 诱变剂及其剂量的选择选择专一性比较强的诱变剂 在具体工作中 多用营养缺陷型的回复突变 抗药性突变 最为方便 形态突变和溶源性细菌的裂解等方法作为筛选诱变剂诱变效应强弱的指标 目前在实际育种中仍采用NTG和EMS等化学诱变剂 但由于多数是引起碱基对转换 得到的突变株的回复变率高 是一大缺点 28 一切诱变剂都具有杀菌和诱变双重效应 当细胞存活率较高时 突变率往往随着诱变剂量的增加而增大 当达到某一数值时 突变率反而降低 这说明在诱变剂的使用中存在着最适剂量 近来认为 杀菌率在70 80 或更低剂量 诱变效果好 特别是经多次诱变后的高产菌株更是如此 29 30 经验认为 经长期诱变后的高产菌株 以采用低剂量处理为妥 对遗传性状不太稳定的菌株 宜用较温和的诱变剂和较低剂量处理 因为对这样的菌株 仅要求能达到发酵单位有所提高就可以了 当选育目的是筛选到具有特殊性状的菌株 或较大幅度提高产量的菌株 可用强的诱变剂和高剂量处理 使基因重排后发生较大变异 容易出现新特性或产量有突破性提高的变异菌株 31 7 中间培养突变基因的出现并不意味着突变表型的出现 表型的改变落后于基因型改变的现象 称为表型延迟 为了克服表型延迟 必须将经诱变处理的菌液进行中间培养 即将一定量的菌液接入完全液体培养基中培养过夜 32 将处理过的细胞转移到营养丰富的培养基中进行培养 使突变基因稳定 纯合并表达 遗传物质经诱变处理后发生的改变 必须经过DNA的复制才能稳定成突变基因 而突变基因则要经过转录和蛋白质的合成才能表达 呈现突变型表型 诱变后的一个小时内必须进行新的蛋白质合成 变异才有效 33 34 35 36 诱变育种程序 37 三 突变型菌株的分离 通过诱变处理 在微生物群体中会出现各种突变型的个体 但其中多数是负变体 为在短时间内获得良好的效果 应该努力设计和采用效率较高的筛选方案及筛选方法 实际工作中 一般分初筛与复筛两个阶段进行 前者以量 选用菌株数量 为主 后者以质 测定数据的精度 为主 38 1 初筛 根据形态变异淘汰低产菌株 在某些菌落形态与生产性能有相关性的情况下 可以采取在平皿上直接筛选 根据平皿生化反应直接挑取高产菌株 常用的有纸片培养显色法 透明圈法 琼脂片法 浓度梯度法等 菌体初筛 是从分离得到的大量菌种中将合成目的产物的菌种筛选出来的过程 初筛可分为平板筛选 粗放 和摇瓶发酵筛选 效果较一致 39 40 利用蛋白酶水解圈 淀粉酶变色圈 纤维素水解圈等 41 采用冷敏感菌筛选抗生素 浓度梯度法 应用复印及快速筛选突变体 琼脂块法筛选突变株 42 琼脂块法预筛流程图 43 琼脂块法预筛琼脂块制备 在直径9cm平皿中定量加入30mL基础培养基 冷却凝固后用直径6mm打孔器打好琼脂块 然后用竹签把琼脂块移至直径9cm空平皿中 单菌落点接琼脂块和培养 挑取 型菌落 或形态变异明显的菌落 点接到琼脂块上 每次诱变最少挑200株 把以上平皿置于保湿盒内 28 培养2d 使活性物质积累于琼脂块中 琼脂块生测 把培养好的琼脂块移到生测平板上 28 培养2d 测量抑菌圈直径 每生测平板挑取抑菌圈最大的菌落2 3个 接种斜面 每次诱变最少挑50株 44 平板菌落预筛 初筛用摇瓶发酵培养 不仅要花费大量的人力物力 而且筛选周期长 限制了筛选数量 降低了高产突变株的获得几率 平板菌落预筛是初筛工作的一部分 从分离平板上挑取菌落进行平板菌落预筛 弃去大量低产菌株 保留其中10 移入试管斜面 再对它们进行摇瓶筛选 才能逐步筛选出高产菌株 45 46 2 复筛 复筛是指对突变株的生产性能做比较精细的测定 需要对突变株发酵培养基的组成 种子培养 接种量 培养温度 培养时间等参数进行精确地测定 找出最佳发酵条件 以便放大 诱变育种实例 纳豆杆菌的诱变育种 阿维链霉菌诱变育种 47 大瓶复发酵复筛用初筛出的5 8株菌成熟斜面孢子接种于装有100mL种子培养基的500mL三角瓶 200r min 28 培养48h 得种子液 取种子液10mL接种于装有80mL发酵培养基的500mL三角瓶中 200r min 28 培养96h 复发酵复筛3批次 每次每株重复接种3瓶 用HPLC法测定发酵液目的代谢产物的含量 筛选出2 4株产量高的变异菌株用于下一轮诱变处理和菌种保藏 48 营养缺陷型是属代谢障碍突变株 常由结构基因突变引起合成代谢中一个酶失活直接使某个生化反应发生遗传性障碍 使菌株丧失合成某种物质的能力 导致该菌株在培养基中不添加这种物质 就无法生长 但是缺陷型菌株常常会使发生障碍的前一步的中间代谢产物得到累积 这就成为利用营养缺陷型菌株进行工业发酵来累积有用的中间代谢产物的依据 3 营养缺陷型auxotroph 49 几个概念营养缺陷型 auxotroph 经诱变产生的一些合成能力出现缺陷 而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株 野生型 wildtype 自然界分离到的任何微生物 在其发生营养缺陷突变前的原始菌株 为该微生物的野生型 原养型 prototroph 指auxo突变菌株回复突变或重组后产生的菌株 与野生型的表型相同 50 筛选用的培养基基本培养基 minimalmedium MM 满足野生型菌株营养要求最低成分的组合 完全培养基 completemedium CM 满足一切auxo生长的天然或半组合培养基 补充培养基 supplementedmedium SM x 在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应auxo生长的组合培养基 51 用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍 紫外线 亚硝酸等 其中亚硝基胍的诱变频率极高 一般可达10 以上 营养缺陷型的筛选方法 一般是经诱变后 再经中间培养 浓缩缺陷型 淘汰野生型 检出营养缺陷型 确定生长谱等步骤 当诱变后缺陷型数量较大时 也可省略中间培养和淘汰野生型等过程 52 53 富集营养缺陷型菌株的方法抗生素法 青霉素 制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞 对休止态细胞无作用 因此可以杀死正常生长的野生型菌株 达到浓缩缺陷型的目的 菌丝过滤法 适用于丝状真菌 原理是基本培养基中 野生型孢子能萌发形成菌丝 而缺陷型孢子不能萌发 差别杀菌法 细菌的芽孢较营养细胞耐热 加热至80 可杀死发育成营养体的野生型芽孢 缺陷型孢子因为仍保持芽孢状态而保留下来得以浓缩 54 营养缺陷型的检出 55 限量补充法 在mm中加0 01 蛋白胨 auxo菌落小 野生型菌落大 56 营养缺陷型的鉴定 生长谱线法 57 营养缺陷型的应用 利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子 58 青霉菌营养缺陷型的获得 59 4 抗性突变株的筛选方法抗性突变包括抗药性突变 抗噬菌体突变 抗结构类似物突变等 抗性突变株的分离方法一般采用梯度平板法 60 61 62 63 64 诱变育种工作包括诱发突变 出发菌株 诱变剂及其剂量的选择 影响诱变效果的因素 突变株的筛选 筛选培养基和培养条件及选择简便 快速有效地筛选方法 和高产变株最佳环境条件的调整 这是决定诱变育种成败的3个方面 围绕这三个环节制订试验方案 65 原生质体 protoplast 最初是由Hanstein用来表示植物细胞壁内的原生质 1952年 Salton用它来表示动植物和微生物细胞去除细胞壁以后的一种细胞结构 1953年 Weibull等人首先用溶菌酶溶解细胞壁获得了原生质体 1958年 Brenner等人提出了细菌原生质体的3条标准 即没有细胞壁 失去细胞刚性 呈球形 对渗透压敏感 第二节原生质体融合育种 66 一 概述 原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除 使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体 然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合 由聚乙二醇 PEG 助融 使它们相互凝集 通过细胞质融合 接着发生两套基因组之间的接触 交换 从而发生基因组的遗传重组 就可以在再生细胞中获得重组体 67 原生质体融合技术是一个人工实验系统 它可将遗传性状不同的两个细胞融合为一个新细胞 属于细胞工程 是现代生物技术的一个重要方面 通过原生质体融合进行基因重组的研究最先在植物细胞中发展起来 随后应用于真菌 最后又扩展到原核生物 并在原核生物方面形成了一个系统的实验体系 已成为代谢控制发酵育种的一种新工具 68 原生质体融合技术具有7个方面的优点 杂交频率较高 受接合型或致育性的限制较小 重组体种类较多 可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体 遗传物质的传递更为完整 可获得性状优良的重组体 69 可提高育种效率 采用温度 药物或紫外线照射等处理纯化一方亲株的原生体 然后再与另一亲株的活原生质体融合 可以在筛选中除去一方亲株 从而提高筛选效率 可采用产量性状较高的菌株作为融合亲株 一般基因重组时必须采用较多的遗传标记 势必使出发菌株的生产性能下降而影响杂交子代的生产水平 但原生质体融合频率较高 可以采用较少标记或不带标记的菌株进行融合 这对改良生产菌株性能更为有效 70 原生质体融合技术还具有存在着两株以上亲株同时参与融合以形成融合子的可能 以及提高菌株产量潜力机率较大等特点 71 二 原生质体融合育种步骤 原生质体融合一般包括如下步骤 标记菌株的筛选 原生质体的制备 原生质体的融合 原生质体的再生 融合子的选择 实用性菌株的筛选 72 原生质体融合基本过程示意图 73 标记菌株的筛选 在原生质体融合的过程中 通常所用的亲株均要有一定的遗传标记以便于筛选 所需的目的基因并不一定与标记基因连锁 融合亲株获得遗传标记的方法可采用常规的诱变育种方法 一般可以以营养缺陷和抗药性等遗传性状为标记 且标记必须稳定 但无须过多 74 原生质体的制备 获得有活力和去壁较为完全的原生质体是原生质体融合育种技术的先决条件 在细菌和放线菌中制备原生质体主要采用溶菌酶 在酵母菌和霉菌中一般可用蜗牛酶和纤维素酶 75 76 77 78 影响原生质体制备的因素有许多 主要有以下几个方面 菌体前处理 如在培养基中添加甘氨酸 蔗糖等 提高细胞壁对酶 溶菌酶 的敏感性 菌体培养时间 一般选择对数生长期 酶浓度 以使原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度作为最佳酶浓度 酶解温度应控制在20 40 酶解时间 79 渗透压稳定剂 原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感 必须在高渗透压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持其生存 在低渗透压溶液中 原生质体将会破裂而死亡 多采用KCl NaCl等无机物和甘露醇 山梨醇 蔗糖 丁二酸钠等有机物 菌株不同 最佳稳定剂亦有差异 除此以外 破壁时的pH值 培养基成分 培养方式 离子强度和种类等对原生质体的形成亦有一定的影响 80 原生质体的融合 PEG诱导融合的机制 PEG可以使原生质体的膜电位下降 然后 原生质体通过Ca2 离子交联而促进凝集 另外 由于PEG渗透压的脱水作用 扰乱了分散在原生质膜表面的蛋白质和脂质的排列 提高了脂质胶粒的流动性 从而促进了原生质体的相互融合 81 原生质体的再生 酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力 即能重建细胞壁 恢复细胞完整形态并能生长 分裂 这是原生质体融合育种的必要条件 原生质体的再生必须使用再生培养基 再生培养基必须与原生质体内的渗透压相等 这就要在其中加入具有一定渗透压的基质即渗透压稳定剂 这与原生质体制备一样 对于不同的微生物来说 其原生质体的高渗再生培养基的主要成分是不同的 82 原生质体的再生是一个十分复杂的过程 至今了解不多 研究认为 若原生质体的细胞壁剥离不彻底 则有助于细胞壁的再生 残留的细胞壁尤如结晶时的 晶种 一样 大量实验亦证明 破壁太彻底往往会引起原生质体再生率的大大降低 影响原生质体再生的因素主要有菌种本身的再生特性 原生质体制备条件 再生培养基成分及再生培养条件等 83 融合子的选择 要获得真正的融合子 必须在融合原生质体再生后 进行几代自然分离和选择 才能加以确定 84 实用性菌株的筛选 微生物原生质体融合是一种新的基因重组技术 它具有定向育种的含义 但是 融合所产生的融合子类型仍然是各种各样的 性能和产量不同的情况仍然存在 需要进行人为定向筛选 85 第三节转导 transduction 转导作用就是利用转导噬菌体作为媒介而将供体菌的部分DNA导入受体菌中 从而使受体菌获得部分遗传性状的现象 整个转导过程包括3个组成部分 即 供体 转导噬菌体 受体 86 普遍性转导 generalizedtransduction 噬菌体可误包供体菌中的任何基因 包括质粒 使受体菌实现各种性状的转导 噬菌体侵染供体菌后 在感染末期 噬菌体会将供体菌的DNA误认为是自己的DNA 并以外壳蛋白将细菌DNA包围起来 形成转导噬菌体 完全普遍性转导能形成遗传性稳定的转导子 87 88 第四节转化 transformation 转化就是指相当大的游离的供体细胞的DNA片段被直接吸收到受体细胞中内 并整合于受体细胞的基因组中 从而使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象 转化后的受体菌称为转化子 来自供体的DNA片段称为转化因子 一般是双链DNA片段 89 整个转化过程包括3个步骤 供体DNA的制备 受体细胞对DNA的吸收 转化子的选择 90 以革兰氏阳性的肺炎双球菌为例 其转化过程如下 双链DNA片段与感受态受体菌细胞表面的特定位点 主要在新形成细胞壁的赤道区 结合 在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解 形成平均分子量为4 5 106的DNA片段 DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除 另一条单链逐步进入细胞 分子量小于5 105的DNA片段不能进入细胞 91 转化DNA单链与受体菌染色体组上的同源区段配对 接着受体染色体组的相应单链片段被切除 并被外来的单链DNA所交换和取代 于是形成了杂合DNA区段 受体菌染色体组进行复制 杂合区段分离成两个 其中之一类似供体菌