免疫学实验教案.doc

键入公司名称免疫学实验教案研究生教育实习潘熙萍(Y20090201)2011/1/14在此处键入文档的摘要。摘要通常是对文档内容的简短总结。在此处键入文档的摘要。摘要通常是对文档内容的简短总结。实验一 免疫血清的制备一、实验目的 熟悉免疫血清的制备过程； 了解动物实验的基本知识。二、实验原理 将抗原物质经适当途径，按照预先制定的免疫方案免疫动物，经过一定时间，可刺激机体产生特异抗体并释放入血液，当血中抗体达到一定效价时采血，分离血清，即为特异性免疫血清（又称为抗血清）。因抗原具有多种表位，可激活多个克隆的B细胞活化产生抗体，因此，这种免疫血清又称为多克隆抗体。 本实验以绵羊红细胞（SRBC）作为免疫原，以家兔为免疫动物，制备兔抗养红细胞免疫血清（也称为溶血素）三、器材和材料1.动物 健康成年家兔，雄性，体重2-3kg；健康成年绵羊。 2.试剂 生理盐水、碘酒、75%酒精。 3.器材 剪刀、镊子、无菌注射器、量筒、无菌毛细滴管、无菌试管、离心管、三角烧瓶（200ml）、动物固定架、手术器械一套、塑料放血管等。 四、 实验步骤1.抗原制备 （1）用碘酒和75% 消毒绵羊皮肤，抽取颈静脉血液，注入含有等量阿氏液的三角烧瓶内，混匀。阿氏液既有抗凝作用，又适于储存SRBC。分装后置4冰箱内，可使用3周。 （2）无菌取上述绵羊血于离心管中，用无菌生理盐水洗涤红细胞，2000r/min，离心5min，吸弃上清液和白细胞层，再用无菌生理盐水与SRBC混匀， 2000r/min，离心5min，重复3次。最后一次离心10min，以使血细胞沉积于管底，弃去上清液。 （3）根据红细胞积压，用生理盐水配成20%SRBC悬液。2.免疫动物 （1）全班分为4组，每组选择健康雄性兔1只，用于免疫。 （2）用全血和SRBC悬液按下述方案免疫兔子。 （3）试血末次注射后第7天，耳静脉采血1ml ,分离血清，用试管凝集试验滴定效价。（1：2000以上可用）3、分离血清（1） 颈动脉放血（心脏采血）并收集于无菌三角烧瓶中凝固后4冰箱过夜，分离上层血清。然后2500r/min离心10min，收集收集上层血清。 （2）收集的血清经鉴定纯化后，小量分装，-20冻存。五、实验结果 收获的血清应无菌，且无溶血现象。兔抗SRBC免疫血清的溶血效价应高于1：2000；兔抗人IgG免疫血清的效价应高于1：16。六、 注意事项抗原制备、免疫动物及采集血清等过程应注意菌操作；免疫的途径、次数、间隔时间因抗原性状不同而异，应合理设计免疫方案，并更具具体情况加以调整；再次注射免疫原时，要防治过敏反应发生。实验二 免疫细胞的形态观察一、实验目的 掌握微量采血及血涂片的制作方法； 学习使用光学显微镜观察免疫细胞 二、实验原理血涂片是临床化验中最常规的技术，也是血液学研究中的最基本技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本，经瑞氏（Wright）染液染色后，不同免疫细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。根据细胞中颗粒的颜色、大小及多少，再结合细胞的大小及细胞核的形态，就可以将免疫细胞进行分类计数。三、器材和材料器材：医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗净的载玻片等试剂：瑞氏（Wright）染液，瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，过滤。贮褐色瓶中备用。（配置时，要先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇，使染料溶液得更好。）四、实验步骤1采血 动物采血时先将耳部剪毛，酒精消毒后，刺破动物耳部皮肤，挤去第一滴血不要。2涂片 挤出第二滴血置于载玻片的一端，再取另一张边缘光滑的载玻片，斜置于血涂片的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以3040O为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄），轻轻将载玻片向前推进，即涂成血液薄膜（如图），推进时速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀。3染色 待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴瑞氏染液盖满血膜为止，染色13min。然后滴加等量的缓冲液（pH6.4）或蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干，镜检。4封片经染色的涂片完全干燥后，用中性树胶封片保存。5观察分别用低倍、高倍和油镜观察血涂片，分辨不同的血细胞类型。五、实验结果 画出血细胞的形态，标出并分析比较各种免疫细胞类型和形态特征。 实验三 大鼠外周血单个核细胞的分离一、实验目的掌握鼠外周血单个核细胞的分离的原理及操作方法。 二、实验原理 血液中各有形成分的比重存在差异，利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque混合溶液（又称淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液界面上，这样就可获得PBMC。三、器材和材料 刻度离心管、吸管、试管、毛细吸管、橡皮乳头、载玻片、盖玻片、离心机等，pH7.2 Hanks液、肝素、生理盐水溶液，淋巴细胞分层液。四、实验步骤1抽取静脉取血2ml，注入含0，1mL肝素溶液的无菌试管中混匀，使血液抗凝。用pH7.2 Hanks液将抗凝血稀释1倍。2离心管：3mLficoll-hypaque分离液，加入4mL稀释血液（缓慢）加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰。3用水平离心机以2000r/min离心20min。 4吸出单个核细胞转移入另一支离心管中，加4倍以上的Hanks液洗涤,混匀，1500r/min，弃上清，加入Hanks液洗涤细胞2次。5最后一次洗涤手,用Hanks溶液将细胞悬液还原至2mL，取样计数。6取2滴细胞悬液将2滴0.4%台盼蓝溶液混匀，静止5min后，取样做湿片镜检，活细胞无色，死细胞蓝色。7. 细胞计数五、注意事项 1、实验所用玻璃器皿应该洁净。如果制备的单个核细胞悬液用于细胞培养时，上述操作过程都要在无菌条件下进行，所用器材、试剂都应为无菌。 2、实验中的细胞得率与室温及分层液比重等有关。分层液应避光4保存。实验五 免疫血清的鉴定一、实验目的 掌握兔抗SRBC免疫血清鉴定的原理，熟悉该方法的操作及结果判定。二、实验原理SRBC作为颗粒性抗原在体外与其相应抗体（兔抗SRBC免疫血清）结合，可出现肉眼可见的凝集块，即凝集试验阳性，说明免疫血清中含有抗SRBC抗体，当SRBC在使馆中与其相应免疫血清结合后，在补体作用下，将导致SRBC裂解，发生免疫溶血反应。当反应体系中的SRBC和补体一定时，其溶血反应程度与免疫血清中的抗体（溶血素）效价呈正比，此即为补体溶血试验，藉此可测定溶血素的效价。三、器材和材料免疫血清1%SRBC悬液补体 豚鼠新鲜血清生理盐水器材 无菌试管、无菌吸管、试管架、恒温水浴箱、玻片等 。四、实验步骤1、取玻片一张，在两端分别加生理盐水和免疫血清各一滴，然后各加入一滴羊红细胞，轻摇玻片，经1-2min，若生理盐水侧红细胞仍均匀浑浊，而在免疫血清侧红细胞凝聚成团，出现小颗粒，即为凝集试验阳性，说明免疫血清中含有抗养红细胞抗体。2、在玻片凝集试验阳性基础上，用补体溶血试验测定免疫血清的效价。（1）取15支小试管，编号列于试管架上，加入生理盐水，第1管0.5mL，第2管0.75mL，第3管1mL，第4-15管各 0.25mL做1:100稀释后,取0.75mL,分别1、2、3号管，每管0.25mL，即成1:300、1:400、1：500稀释之溶血素，然后再进行倍比稀释。（2）另设第16号对照管，混匀后置37水浴箱30min，观察结果。五、实验结果 观察溶血现象，以呈现完全溶血的血清最高稀释度为溶血素效价。六 、注意事项实验所用补体采用豚鼠新鲜血清。补体性质极不稳定，需对实验条件和个环节加以严格控制。兔抗人IgG免疫血清的鉴定科采用双向免疫扩散法。实验六 免疫血清的纯化一、实验目的 掌握血清纯化原理与鉴定。二、实验原理SRBC作为颗粒性抗原在体外与其相应抗体（兔抗SRBC免疫血清）结合，可出现肉眼可见的凝集块，即凝集试验阳性，说明免疫血清中含有抗SRBC抗体，当SRBC在使馆中与其相应免疫血清结合后，在补体作用下，将导致SRBC裂解，发生免疫溶血反应。当反应体系中的SRBC和补体一定时，其溶血反应程度与免疫血清中的抗体（溶血素）效价呈正比，此即为补体溶血试验，藉此可测定溶血素的效价。三、器材和材料免疫血清1%SRBC悬液补体 豚鼠新鲜血清生理盐水器材 无菌试管、无菌吸管、试管架、恒温水浴箱、玻片等 。四、实验步骤1、取玻片一张，在两端分别加生理盐水和免疫血清各一滴，然后各加入一滴羊红细胞，轻摇玻片，经1-2min，若生理盐水侧红细胞仍均匀浑浊，而在免疫血清侧红细胞凝聚成团，出现小颗粒，即为凝集试验阳性，说明免疫血清中含有抗养红细胞抗体。2、在玻片凝集试验阳性基础上，用补体溶血试验测定免疫血清的效价。（1）取15支小试管，编号列于试管架上，加入生理盐水，第1管0.5mL，第2管0.75mL，第3管1mL，第4-15管各 0.25mL做1:100稀释后,取0.75mL,分别1、2、3号管，每管0.25mL，即成1:300、1:400、1：500稀释之溶血素，然后再进行倍比稀释。（2）另设第16号对照管，混匀后置37水浴箱30min，观察结果。五、实验结果 观察溶血现象，以呈现完全溶血的血清最高稀释度为溶血素效价。六 、注意事项实验所用补体采用豚鼠新鲜血清。补体性质极不稳定，需对实验条件和个环节加以严格控制。兔抗人IgG免疫血清的鉴定科采用双向免疫扩散法。实验七 酶联免疫吸附试验(ELISA)-间接法一、实验目的掌握间接法酶联免疫吸附试验的原理。熟悉间接法的操作步骤。二、实验原理1、ELISA基本程序：抗原和抗体发生特异性结合，吸附于固相载体上，加入酶标抗体或酶标二抗，形成抗体-抗原-酶抗体复合物（双抗体夹心法），或者抗原-抗体-酶标二抗复合物（间接法），加入底物和显色剂后，酶催化底物进行水解，氧化或还原等反应。呈现显色反应，酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。2、用于标记的酶：辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶3、双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，而间接法是检测抗体最常用的方法。三、器材和材料绵羊红细胞 抗原兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素） 待测兔血清HRP标记羊抗兔IgG 二抗包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS底物溶液：TMB酶标板，酶标仪。四、实验步骤1、包被抗原：使用包被缓冲液10000被稀释绵羊红细胞，加入酶标板中，4 过夜；洗涤3次，每次间隔3 min，拍干；2、封闭：5%脱脂奶粉 37 封闭0.5 h， 200 L /孔，拍干；3、加样：每人加样2列（16孔），2孔加入5000倍或10000倍稀释的待测兔血清，设置空白对照和不抑制对照， 37 孵育1h洗涤3次，每次间隔3 min，拍干；4、加酶标二抗：加入11000 稀释的羊抗兔酶标二抗，每孔100L，37孵育1 h，洗涤同上；5、显色：加入TMB底物显色液，100 L /孔，37，15 min；6、终止读数：加入2 M的浓硫酸终止显色反应，50 L /孔，用酶标