临床免疫学免疫原和抗血清制备.doc

第三章免疫原和抗血清制备本章考点1.免疫原制备2.抗血清制备3.抗体的纯化和鉴定 第一节免疫原的制备 免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 一、颗粒性抗原的制备颗粒性抗原如各种细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可； 细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。有的需经特殊处理，如鞭毛抗原需用0.3%0.5%甲醛处理；菌体抗原加温10022.5h去除鞭毛抗原；毒素抗原则在杀菌后再加0.5%l.0%氯化钙溶液等。 颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂作皮内注射。 二、可溶性抗原制备蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原，免疫前常需纯化。 （一）组织和细胞抗原的制备 1.组织和细胞抗原的制备：通常需要先将来源于人和动物的组织和细胞破碎，再经一定的方法纯化，才能获得所需的抗原。细胞破碎方法有： （1）高速组织捣碎机法； （2）研磨法（可用组织匀浆器或乳钵） 组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。 2.组织细胞或培养细胞可溶性抗原制备：除上述机械捣碎获取外，尚有酶处理法，常用胃蛋白酶或胰酶，可获得游离的单个细胞。 细胞抗原分膜蛋白抗原、细胞质抗原（主要为细胞器）、细胞核与核膜抗原，制备这些抗原前均需将细胞破碎，方法有： （1）反复冻融法：一般-20反复冻融。 （2）超声破碎法：利用超声波机械振动原理使细胞破碎。 （3）自溶法：利用组织、细菌自身酶系统使之裂解。 （4）酶处理法：常用溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等使细菌或组织裂解。 （5）表面活性剂处理法：常用十二烷基硫酸钠等表面活性剂处理。 （二）超速离心分离法 用于分离亚细胞成分和蛋白质，是进一步纯化的第一次过筛。可分下列方法： 1.差速离心法：低速离心高速离心交替进行，分离大小差异的抗原颗粒； 2.梯度密度离心法：是一种区带分离法，通过梯度密度离心，使各类分子量的颗粒得以分离，也可以采用梯度柱的形式分离。 超速离心分离或梯度密度离心仅适用于少数大分子抗原及一些比重较轻的抗原，而不适用于大多数中、小分子抗原。 （三）选择沉淀法 选择沉淀法是采用各种沉淀剂或某些条件使抗原成分沉淀的方法。 1.核酸去除法：可采用氯化锰、硫酸鱼精蛋白等核酸提取沉淀剂，而核糖核酸降解法更简便（采用DNA或RNA酶）； 2.盐析沉淀法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩； 3.有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮； 4.水溶性非离子型聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物为分子量为20006000的聚乙二醇（PEG）。 （四）凝胶过滤法 又称分子筛层析。通过凝胶分子筛作用，可将大、中、小三类分子分开，选择凝胶柱时应注意选用适于分离范围内的凝胶。 （五）离子交换层析法 离子交换层析是利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。常用的离子交换剂有： 1.具有离子交换基团的纤维素。 2.具有离子交换基团的交联葡萄糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺。 3.被覆以离子化物质的细粉。 4.凝胶合成的高度交联树脂。 （六）亲和层析法 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体、DNA和RNA等之间有特殊亲和力，一定条件下，两者可紧密结合成复合物，如将复合物的一方固定于固相载体上，则可从溶液中分离和提纯另一方。 1.亲和层析支持物的选择：常用的有琼脂糖珠（sepharose2B、4B、6B）、琼脂糖、聚丙乙烯酰胺、多孔玻璃球等。 2.配体的选择：配体指具有亲和力的双方，或与受体特异性结合的结构物，作为免疫亲和层析则为抗原和抗体的同义语。良好配体必须具备抗原和抗体单一特异性；抗原和抗体间有较强亲和力；配体有一适宜的化学基团。 3.抗原或抗体与支持物的结合：结合的方法很多，可归纳为载体结合法、物理吸附法、交联法、网络法。 （七）免疫球蛋白片段的制备五种免疫球蛋白都具抗原性、皆可提取及纯化，但如分解成片段（如Fab片段、Fc片段、轻链片段等）作为免疫原可制备出分辨力更高的特异性抗血清。制备方法有： 1.温和条件下离析亚单位。如改变pH；用盐酸胍或脲等强变性剂将亚单位分开； 2.用还原法或氧化法解离二硫键； 3.溴化氰裂解法。用溴化氰裂解蛋白质肽链； 4.酶裂解法。如木瓜酶可将IgG裂解成2个Fab片段及1个Fc片段；胃蛋白酶可将IgG裂解成F（ab）2片段及数个小片段；胰蛋白酶可将IgG切成不规则的肽链。 （八）纯化抗原的鉴定主要对纯化抗原的含量、理化性质、纯度及免疫活性进行鉴定，常用方法有酚试剂法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、免疫电泳法、免疫双扩散法等，实际工作中常几种方法联用作纯度鉴定。 三、半抗原性免疫原的制备半抗原：某物质在独立存在时只具有反应原性而无免疫原性，这些物质称为半抗原。如一些分子量小于4000的有机物质，如多肽、大多数的多糖、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些小分子量的药物等。 半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性。 （一）载体的选择1.蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白、牛甲状腺球蛋白等。以牛血清白蛋白最常用。蛋白质与半抗原结合基于游离氨基、羧基、酚基、巯基、吲哚基、咪唑基、胍基等活性基团的缩合。 2.多肽类聚合物：常用多聚赖氨酸，分子量达十几万至几十万，与半抗原结合后可诱发动物产生高亲和力及高滴度的抗血清。 3.大分子聚合物和某些颗粒：聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、羧甲基纤维素等皆常用。 （二）半抗原-载体联接方法 1.碳二亚胺法。 2.戊二醛法。 3.氯甲酸异丁酯法。 一般认为应连接20个以上半抗原才能使动物有效产生抗体。 第二节免疫佐剂 与抗原同时或预先注射于机体能增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的辅助物质称为免疫佐剂。（一）佐剂种类 1.具备免疫原性的佐剂：如卡介苗、枯草分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、脂多糖、细胞因子等。2.不具备免疫原性的佐剂：如氢氧化铝佐剂、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、多聚核苷酸、胞壁肽等。应用最多的是福氏佐剂、细胞因子佐剂。 （1）福氏佐剂：分完全福氏佐剂（石蜡油+羊毛脂+卡介苗）、不完全福氏佐剂（石蜡油+羊毛脂）两种。福氏完全佐剂可提高佐剂效能，但注射后易产生局部持久性溃疡和肉芽肿，宜注意。（2）细胞因子佐剂：细胞因子佐剂与抗原合用，可有效激发机体的免疫功能。IL-2、IL-1、IFN、IL-12、GM-CSF皆较常应用；细胞因子佐剂还被广泛应用于肿瘤基因治疗中。（二）免疫佐剂的作用应用佐剂的目的是为了增强抗原对机体的免疫原性，从而提高体液免疫应答和细胞免疫应答水平。1.增强免疫原性。2.增加抗体的滴度。3.引起或增强迟发型超敏反应。（三）佐剂增强免疫应答的机制1.改变抗原物理性状，使抗原在体内缓慢释放，延长抗原与免疫细胞作用时间。2.抗原在佐剂的辅佐作用下，更易被巨噬细胞吞噬和有效加工处理及呈递。3.刺激单核巨噬细胞活化，释放细胞因子调节和增强淋巴细胞免疫应答能力。4.刺激淋巴细胞增生、分化，从而增强和扩大免疫应答能力。第三节抗血清的制备抗血清指含有抗体的血清。传统的抗血清制备方法是将某种抗原通过多次注入动物，数十天后或数月后，采集动物血，立即分离出血清。此抗血清在保存或应用前必须作效价和特异性鉴定及纯化。（一）免疫动物的选择免疫动物的选择基本要求： 1.抗原与免疫动物的种属差异越远越好。2.动物必须适龄、健壮、无感染、体重合乎要求。3.不同动物对同一免疫原有不同的免疫应答表现。因此针对不同性质的免疫原，选用相应的动物。蛋白质抗原大部分动物皆适合；甾类激素多用家免；酶类多用豚鼠。4.抗血清要求：为R（rabbit）型或H（horse）型血清。R型抗血清是以家兔为代表的小型动物产生的抗血清，能和很小量抗原结合形成沉淀线，而H型抗血清则以马为代表的大型动物产生的抗血清，较少用于沉淀反应。此外需要制备大量免疫血清时，应选用马、绵羊等大动物；若需要量不多，则选用家兔、豚鼠和鸡等小动物。（二）免疫方法及途径1.免疫原的注射剂量：应考虑抗原性强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。抗体需要量多，时间间隔长，剂量可适当加大。2.免疫途径：通常有静脉、腹腔、肌肉、皮内、皮下、淋巴结及足掌等。若抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法；半抗原宜皮内多点注射。3.免疫方案：根据设计的目的要求、抗原性质、佐剂的种类来制定免疫方案。可采用全量免疫法、微量免疫法或混合免疫法。4.抗体产生阶段：可分静止期（约2天，血中尚无抗体）；指数期（约4天左右，抗体迅速上升）；稳定期（约24周，抗体保持一个稳定水平）；下降期（约几个月后，此时抗体缓慢下降）四个阶段。（三）动物采血法动物采血法有颈动脉放血法、心脏采血法、静脉多次采血法等。 第四节抗血清的鉴定和保存 一、特异性抗体的鉴定1.抗体特异性鉴定：常采用双向免疫扩散法。2.抗体的效价的鉴定：常采用双向免疫扩散法。一是仅稀释抗血清，与同一浓度抗原反应；另一是抗血清、抗原同时稀释作棋盘滴定。3.抗体的纯度鉴定：常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定。二、抗血清的保存动物血采集后，室温自然凝固后立即分离出血清，妥善保存。抗血清保存有三种方法：第一种是4保存，通常可保存3个月半年，效价高时可保存一年左右；第二种是-20-40低温保存，可保存5年左右，但需防止反复冻融；第三种是真空冰冻干燥保存，可保存510年。 第五节抗血清的纯化纯化的目的是尽量去除抗血清中与目的抗体不相关的成分，防止与特定抗原反应时起干扰作用。最常见的纯化方式是提取特异性IgG或单价特异性抗血清。一、特异性IgG抗血清制备首先用硫酸铵或硫酸钠盐析法粗提丙种球蛋白，再进一步纯化，常用的方法有：1.离子交换层析法：离子交换剂有DEAE纤维素和QAE纤维素。2.凝胶过滤：通过多孔凝胶介质达到分离目的。3.亲和层析法：采用纯化抗原或粗提抗原交联的sepharose 4B的层析柱来制备。4.酶解法 如制备F（ab）2：片段用胃蛋白酶水解制备。二、单价特异性抗血清制备主要通过亲和层析法（交叉杂抗原与琼脂糖珠4B交联制成层析柱）和吸附法（用双功能试剂与抗原交联，制成固相吸附剂）除去杂抗体。习题19 抗原必须具备的基本特性是A.有免疫原性、无免疫反应性B.无免疫原性、有免疫反应性C.分子量大、化学结构复杂D.有免疫原性和免疫反应性E异物性、复杂性答疑编号500734030201正确答案D习题20 兼有免疫原性及免疫反应性的抗原物质称为A.简单半抗原B.复合抗原C.阻断抗原D.完全抗原E. 封闭抗原答疑编号500734030202正确答案D习题21 免疫原性是指抗原分子A.能与应答产物发生特异性反应的特性B.不能与应答产物发生特异性反应的特性C.能诱导免疫应答的特性D.不能诱导免疫应答的特性E.与载体结合后诱导免疫应答的特性答疑编号500734030203正确答案C答案解析免疫原性又称为抗原性，是指能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。即指抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫反应。习题22 关于半抗原的叙述，正确的是A.必须与载体结合后才能与相应的抗体结合B.既无免疫原性，又无免疫反应性C.不能刺激机体产生抗体，但可与相应抗体发生反应D.无免疫原性的小分子物质E.可刺激机体产生抗体答疑编号500734030204正确答案C答案解析某物质在独立存在时只具有反应原性而无免疫原性，这些物质称为半抗原。与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性。习题23 必须与蛋白质载体结合才具有免疫原性的是A.半抗原B.变应原C.免疫佐剂D.超抗原E.完全抗原答疑编号500734030205正确答案A习题24 下列哪种说法正确A.半抗原+血清白蛋白动物产生抗体 B.半抗原动物产生抗体 C.半抗原+药物动物产生抗体 D.半抗原+激素动物产生抗体 E.半抗原+电解质动物产生抗体 答疑编号500734030206正确答案A答案解析半抗原只有与载体结合后才具有免疫原性。常用载体有蛋白质类、多肽类聚合物和大分子聚合物和某些颗粒。习题25 抗血清效价的滴定可采用（抗血清特异性鉴定方法是）A.免疫电泳和区带电泳B.聚丙烯酰胺凝胶电泳C.定量沉淀法和免疫电泳D.免疫双向扩散和定量沉淀法E.血凝法和单向琼脂扩散答疑编号500734030207正确答案D答案解析抗体的效价的鉴定：常采用双向免疫扩散法。一是仅稀释抗血清，与同一浓度抗原反应；另一是抗血清、抗原同时稀释作棋盘滴定。第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术本章考点1.概念2.杂交瘤技术基本原理3.杂交瘤抗体的制备技术4.基因工程抗体由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。 传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。 第一节杂交瘤技术基本原理 单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。一、B细胞杂交瘤技术 1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT培养基上长期存活与繁殖。3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。图13 杂交瘤技术操作主要流程示意图二、T细胞杂交瘤 T细胞杂交瘤可分为小鼠细胞杂交瘤和人T细胞杂交瘤。 其基本过程是将激活的细胞与酶缺陷型淋巴瘤细胞融合，通过有限克隆稀释，获得特异性表达细胞受体（TCR）或其他功能的杂交瘤细胞。其主要步骤为： 1.淋巴瘤细胞系的选择要求有以下特征： （1）体外能无限、快速生长。 （2）融合率高。 （3）不分泌淋巴因子和杀伤功能。 （4）缺乏某一特异性的细胞表面抗原或受体。 （5）HGPRT酶缺陷型。 2.特异性细胞的制备与活化：主要有可溶性抗原诱导激活的细胞、同种反应性细胞、人的特异性细胞等。 3.T细胞杂交瘤的筛选。三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养 杂交瘤细胞形成后的初期很不稳定，为确保单克隆抗体的专一性及避免其他阴性细胞对其生长影响，必须将阳性杂交瘤细胞进行单细胞分离培养，产生单克隆杂交瘤细胞，经23次检测均为阳性的杂交瘤单个细胞，才能进行克隆化培养。 克隆化培养后的阳性杂交瘤细胞应及时冻存，最好保存在-196液氮中。 第二节单克隆抗体的制备技术 利用杂交瘤技术制备McAb基本原理是根据三个原则：（1）淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说；（2）杂交瘤细胞保持双方亲代细胞特性化；（3）然后大量培养增殖，制备所需的McAb。一、单克隆抗体的产生 1. 动物体内诱生方法：目前McAb治疗用或体外诊断用的多数尚采用这一方法制备。先在小鼠腹腔注射液体石蜡或福氏不完全佐剂，一周后将杂交瘤细胞悬液注射腹腔，l2周后，无菌抽取腹水，离心取上清液即可。 2.体外培养法：这是实验室制备的方法。将杂交瘤细胞置培养瓶中培养，待培养液颜色改变或细胞过多开始死亡时，收集上清液，离心去掉碎片及细胞即可。另一种是杂交瘤细胞高密度培养法。二、单克隆抗体的纯化及鉴定 目前常用的纯化方法有盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等方法。 单克隆抗体性质鉴定方法如放免测定、补体介导溶血试验、ELISA、免疫酶、玫瑰花结形成试验等，最常用的为ELISA方法，一般先作定性试验，如阳性，进一步作定量检测。 第三节单克隆抗体医学中的应用 单克隆抗体目前全世界已研制成数以万计，在生物及医学界有着广泛用途，在医学中已经用于： 1.作为诊断试剂，用于诊断各类病原体，目前这是McAb应用最多的领域之一。 2.肿瘤特异性抗原和相关抗原的检测：用于肿瘤的诊断、分型及定位。 3.检测淋巴细胞表面标志物，用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。 4.抗原微量成分的检测及对酶类、激素、维生素、药物等的检测。 5.在防治工作中如恶性肿瘤的治疗，“生物导弹”的研制等都有广泛前景。 6.研究工作中用作“探针”，确定大分子生物物质在细胞中的分布及位置。 7.用于抗原物质的提取及纯化。 第四节基因工程抗体技术 由于杂交瘤单克隆抗体为异源性蛋白，应用于人时易产生抗小鼠抗体，基因工程抗体通过基因工程技术改造现有优良的鼠单克隆抗体基因。尽量减少抗体中鼠源成分，保留原有抗体特异性，从而创造出一种新型抗体。一、人源化抗体 人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。 1.人-鼠嵌合抗体 此抗体为通过基因工程技术，将人IgG C区与鼠IgV区连接，导入细胞内表达制备而成的抗体。 2.抗体的表面修饰，使Fv表面人源化。二、小分子抗体 此为分子量小，具有抗原结合功能的分子片段，包括Fab，Fv，单链抗体，单区抗体等。 此种抗体分子量小，可在大肠杆菌等原核细胞表达，在人体内穿透力强，有利于疾病的治疗。三、抗体融合蛋白 将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到多样性生物功能的融合蛋白，如： 1.含Fv