光谱分析技术.ppt

第三章光谱分析技术 第一节吸收光谱分析第二节散射光谱分析第三节发射光谱分析 学习目标 掌握吸收光谱分析原理 比色的标准曲线法 标准对比法 摩尔吸光系数法 分光光度计的结构及波长检测 比色皿的配套检测 熟悉722型分光光度计的使用 散射光谱法 发射光谱法 了解原子吸收分光光度法 光谱技术是根据物质吸收或发射辐射能而建立起来的一类分析方法 因不同分子的原子团和原子 其发射光谱和吸收光谱不同 而相同的物质在一定条件下 其发射光谱和吸收光谱的强度与该物质的含量成正比关系 因此可对物质进行定性和定量分析 此类技术称为光谱技术 光谱分析技术是一种最常用的生化检验技术 它主要包括 吸收光谱分析 可见 紫外 红外分光光度法和原子吸收分光光度法散射光谱分析 比浊法发射光谱分析 火焰光度法 原子发射光谱法和荧光光谱法 光是一种高速传播的电磁波 光的波长 的常用单位是纳米 nm 可见光波长400 760nm 400nm称为紫外光 760nm称为红外光 波长愈短 能量愈大 可见 紫外吸收光谱是由于多原子分子的价电子在电磁辐射的作用下 由基态跃迁到激发态 这种因物质分子对辐射能的选择性吸收而得到的光谱称为吸收光谱 第一节吸收光谱分析 吸收光谱分析法包括可见 紫外 红外和原子吸收分析法 其中最常用的是可见光分析法 也被不严格地称为比色分析法 准确的名称应是可见光分光光度法 用于比色分析的光源与被测溶液的颜色应为互补色 可见 紫外吸收光谱用于定量分析的依据是光吸收定律 即Lambert Beer定律 它是吸收光谱法的基本定律 一 Lambert Beer定律1 Lambert定律当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后 由于溶液吸收了一部分光 则透过的光线为It 当溶液浓度不变时 透过的液层愈厚 则光线强度的减弱愈显著 It I0 用数学式表示为 透光度随溶液厚度增加而减少 其关系是透光度的负对数 lgT 吸光度A 与溶液厚度成正比 即 2 Beer定律当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后 若液层厚度不变 而浓度不同时 溶液的浓度愈大 则透过光的强度愈弱 其定量关系A K C 当液层厚度不变时 吸光度与溶液浓度成正比 这就是Beer定律 3 Lambert Beer定律合并Lambert定律与Beer定律可得A K L C说明吸光物质对单色光吸收的强度与物质的浓度和液层厚度成正比 吸光系数K的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度 在给定条件下 波长 溶液性质 浓度 吸光系数是物质的特征常数 K值愈大 能测定的浓度C愈小 则灵敏度愈高 二 比色分析仪器即可见光分光光度计 各类分光光度计的结构和原理基本相同 一般包括光源 单色器 吸收池 检测器和显色器五大部分 1 光源可见光常用钨灯 现用卤钨灯 紫外光常用氢灯 2 单色器可用滤光片 棱镜 光栅 3 吸收池 比色杯 4 检测器光电管或光电倍增管5 显示器指针式或数字式 三 比色分析的特点1 灵敏度高被测定物质的最低浓度一般为10 5 10 6mol L 2 测定快速 简便 3 应用范围广一些无色物质在一定条件下与显色剂反应 可生成有色物质 四 比色分析的定量方法 一 对比法又称标准对比法 通常在测定未知浓度样品的同时 测定一已知浓度的标准液作比较 然后分别测定两者的吸光度 AS K LS CSAU K LU CU 因测定成分相同 故K值相同 比色时用同样规格的比色皿 故LS LU 所以比色分析中标准液与样品液的吸光度比值就等于其浓度比 即CU CS若标准液与样品用量不等时 则再乘 用对比法进行定量时 为了减少误差 选用标准液浓度应尽可能接近待测样品浓度 二 标准曲线法配制一系列浓度不同的标准液 按一定操作方法显色后 用选定的波长分别测定它们的吸光度 然后以吸光度为纵坐标 标准液浓度为横坐标 在坐标纸上标出各坐标点 通过连接各点 使其成一直线 即A C曲线 注意事项1 测定条件发生变化时 如更换标准品和试剂等 应重新绘制 2 标准品应有高的纯度 标准液的配制应准确 3 当待测液吸光度超过线性范围时 应将标本稀释后再测定 4 标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致 五 原子吸收分光光度法 一 基本原理待测元素经原子蒸气发生器转化成气态原子 处于基态 由空心阴极灯提供的待测元素的共振线经过待测元素的蒸气 共振辐射强度被蒸气中待测元素的基态原子吸收而减弱 其吸收规律遵循Beer定律 即在一定条件下 原子吸收与该物质浓度成正比 共振线 电子从基态跃迁至第一电子激发态的最低振动能级所吸收的谱线为共振吸收线 简称为共振线 二 应用在医学检验中主要用于体液 毛发 指甲等组织钙 镁 铁 钠 锌 铝 汞 铅 砷等多种元素的测定 优点 1 选择性好 受干扰少 原子吸收是光的窄带吸收 仅0 001 0 01nm 而分子对光的吸收是宽带吸收 达几个nm 2 灵敏度高 较火焰光度分析高1 2个数量级3 测定快速 简便4 应用范围广 可测元素达70多种 但需更换不同空心阴极灯 仪器昂贵 第二节散射光谱分析 当一束可见光照射在胶体溶液时 在垂直于入射光的方向可观察到一个发亮的光锥 此现象称为丁铎尔现象 这是由于胶体粒子散射光的结果 测定可见光通过胶体溶液 混悬液 时的光散射程度的一类分析方法称为散射广谱分析法 散射光谱分析过程与比色分析类似 常用的方法为比浊法 其测定原理 方法 计算等均与比色法相似 但本质不同 比色分析测定的是吸收光强度变化 而散射光谱分析测定的是散射光强度变化 透射比浊法精度差散射光谱分析散射比浊法需散射光度计在临床上应用最多的是免疫比浊法 一 火焰光度法是利用火焰使金属元素激发 能发射出特征谱线的特点进行测定的一种方法 一 基本原理某些金属元素的基态原子受到火焰激发后 其外层电子获得能量而从基点跃迁到激发态 接着它们又以发射光谱的形式释放出所获得的能量 而返回基态 在相同条件下 同一元素所释放的单位能量相同 故能形成固定光谱 而不同的元素受激发后所发射光谱不同 第三节发射光谱分析 如钠发射光谱波长589nm 钾发射光谱波长767nm由于火焰供给的能量低 只能激发碱金属和碱土金属元素 生化检验中常用于钾 钠的测定 元素的发射谱线强度与该元素浓度的关系可表示为I C 是与试样组成 激发温度 激发电位有关的常数 即发射谱线强度与测定元素浓度成正比 二 影响火焰光度法测定的因素1 共存元素的影响由于火焰使标本中其他元素激发 当发射时光谱接近 甚至重叠时 可产生干扰 引起误差 如钙对锂 钠的测定干扰明显 2 火焰的影响火焰是激发光源 火焰的纯度和燃烧状态 稳定性 可直接影响分析结果的准确度 因此 要求所用燃料燃烧时火焰背景色浅 温度高 无杂色 3 标准品的影响以单纯的被测物质预制标准液则与血清样品的结果相差甚远 故应使用定值血清作为标准以消除影响 二 荧光分析法利用某些物质受紫外光照射后发出特有的荧光 籍此对物质进行定性 定量分析的方法 一 基本原理某些物质的分子吸收了光能 激发光 从基态跃迁至激发态 处于激发态的的分子通过运动或与其他分子的碰撞而将吸收过多的能量输给其他分子 并返回到激发态 同时产生荧光 发射光 产生荧光强度最强的激发光波长称为最大激发波长 ex 得到的荧光强度最强的波长称为最大荧光波长 em 荧光强度 F 与物质浓度 C 定量关系表达式 F kC在一定浓度范围内 其荧光强度与溶液浓度呈正比关系 据此可测定荧光物质的含量 二 仪器与定量分析方法作为荧光分析的仪器有光电荧光计和荧光分光光度计 光电荧光计的结构与光电比色计很相似 不同之处是检测器与光线成直角 并多一块滤光片 如滤光片改为棱镜或光珊作单色器 就和可见紫外发光光度计相似而成荧光分光光度计 荧光分光光度计的光源为氙弧灯 发射的强烈紫外线对人眼有害 荧光定量分析方法同比色分析法 四 临床应用荧光分析优点 1 灵敏度高比可见紫外吸收光谱高103 104倍 2 特异性强通过选择合适的激发光波长和荧光波长可避开其它物质干扰 3 操作简便 快速 重现性好4 样品用量少 不足之处 1 应用范围有一定局限性 因许多物质不能产生荧光 2 对测定条件要求严格 如试剂 溶剂不应含有荧光物质 3 仪器价格较贵荧光分析法在医学检验中可用于测定类固醇激素 肾上腺皮质激素 及代谢产物 单胺类神经递质 儿茶酚胺 5 HT 某些维生素 VitA B族 本章小结 1 光谱分析技术的分类 吸收光谱分析 散射光谱分析和发射光谱分析 2 吸收光谱分析可见分光光度法 光吸收定律 比色分析仪器 比色分析的特点及比色分析的定量方法 原子吸收分光光度法 3 发射光谱分析火焰光度法 基本原理 影响火焰光度法测定