临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用

临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用 化学发光 荧光偏振 微粒子酶放大化学发光电化学发光 时间分辨免疫荧光抗体芯片透射和散射比浊流式细胞技术 免疫扩散 免疫沉淀 免疫凝集 ELISA IFARIAICT 免疫学和自动化技术在临床免疫学诊断领域中的应用将大大加速 标记免疫学分析技术发展历程 免疫荧光分析 Coons 1941 放射免疫分析 Berson和Yalow 1960 酶联免疫吸附分析 Engvall 1971 金标免疫分析 Faulk和Taylor 1971 化学发光免疫分析 Arakawa 1977 时间分辨荧光免疫分析 Soini和Hemmila 1979 电化学发光免疫分析 Leland 1990 近代临床免疫诊断技术发展历程 临床免疫诊断技术的发展基本历经了以下三个阶段 近代临床免疫诊断技术发展历程 技术成熟度高放射性 125I 污染和危害125I的半衰期短 试剂有效期短标记物125I的稳定性差 批间 批内的变异较大标准曲线有效期短 必须每次定标操作繁琐 出报告时间长无法保存备用 放射免疫技术 RIA RosalynYalow 1977 成本低廉定性 半定量和定量均可以检测O D值在低中浓度范围与酶活性呈线性关系可以肉眼简单判读或酶标仪准确判读结果 酶免疫分析技术 EIA 灵敏度高 检测低限达10 19mol测定范围宽 可达9个数量级自动化程度高 操作简单试剂稳定性好 无污染有效期6 24月 化学发光免疫分析 CLIA BAYERACS180 AxSYM Elecsys2010System Access 2ImmunoassaySystem 最先进的免疫学分析技术之一非开放性试剂系统 试剂价格过高 电化学发光免疫测定 Electrochemiluminescenceimmunoassay ECLI 是电化学发光 ECL 和免疫测定相结合的产物 它的标记物的发光原理与一般的化学发光 CL 不同 是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应 实际上包括了电化学和化学发光二个过程 ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应 而CL是通过化合物混合启动发光反应 Elecsys2010System 免疫学检验技术发展趋势 快速简便 精确灵敏 集成高通量 金标免疫层析检测磁珠免疫层析检测 化学发光时间分辨荧光AlphaScreen 阵列芯片液相悬浮芯片 化学发光免疫分析技术及其在临床诊断中的应用 简史 本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析 利用发光的化学反应分析超微量物质 特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质 目前 这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段 原理 发光底物在酶的作用下 底物发生化学反应并释放出大量的能量 产生激发态的中间体 这种激发态中间体 当其回到稳定的基态时 可同时发射出光子 利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额 该光量子产额与催化的酶的量成正比 由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量 CLIA试剂盒国产化程度已经较高 质量与国外产品的差距逐渐减小 缺乏国产化的自动检测仪器 化学发光免疫分析发展史CLIA 发光检测方法分类和对比 化学发光免疫分析种类 1 直接化学发光A吖啶酯发光原理 纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物 在含H2O2的强酸 强碱激发底物的作用下 快速发出可见光 通过光电倍增管进行光子计数 相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系 特点 发光过程在5秒内完成 激发发光程序简单 测试速度快 但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定 易水解 影响试剂稳定性 代表仪器 拜耳公司的ACS180 雅培Architect 原理图 化学发光免疫分析种类 B异鲁米诺发光原理 发光过程和原理与吖啶酯完全相同 但激发发光速度更快 在3秒内完成整个过程 测试速度最快 而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定 易水解的缺点 代表仪器 德国Byk Sangtec公司的LIAISON 原理图 2 酶促化学发光或持久发光原理 酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶 AP 或辣根过氧化物酶 HRP 标记在抗体或抗原上 固相抗体或抗原与AP或HRP标记的抗原 抗体复合物在发光底物AMPPD或Luminol作用下 持续发出可见光 通过光电倍增管读取光信号 特点 碱磷酶体系 水解反应 起光较慢 发光强度较弱 灵敏度较高 辣根酶体系 氧化还原反应 起光较快 发光强度较大 代表仪器和试剂 进口品牌 强生VitrosECi 鲁米喏 美国贝克曼公司的ACCESS AMPPD 国产主要厂家 郑州安图 HRP LUMINOL 北京源德 HRP LUMINOL 泰格可信 HRP LUMINOL 科美东雅 AMPPD 威海威高 HRP LUMINOL 等 化学发光免疫分析种类 VitrosECi 鲁米喏 原理图 英国强生VitrosECi 鲁米喏 3 电化学发光原理 纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物 在三丙胺的作用下 发生氧化还原反应 发出可见光 通过光电倍增管进行光子计数 相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系 特点 激发发光过程复杂 时间长 每一个发光过程约需25秒 测试速度慢 代表仪器 瑞士ROCHE公司的ELECSYS1010和ELECSYS2010 化学发光免疫分析种类 电化学发光检测技术 ELECSYS1010ELECSYS2010 原理图 罗氏 RocheDiagnostics 1结合了活化的三联吡啶钌衍生物即 Ru bpy 3 2 N羟基琥珀酰胺酯 NHS 的抗 HBs和结合了生物素的抗 HBs与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟 操作步骤 将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中 再次孵育9分钟 使生物素通过与亲和素的结合将磁珠 抗 HBs连接为一体 形成双抗体夹心法 3蠕动泵将形成的 Ru bpy 3 2 抗体 抗原 抗体 磁珠复合体吸入流动测量室 此时 磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面 同时 游离的抗 HBs 与生物素结合的和与 Ru bpy 3 2 结合的抗体 也被吸出测量室 4蠕动泵加入含三丙胺 TPA 的缓冲液 同时电极加电压 启动ECL反应过程 5终止电压 移开磁珠 加入清洗液冲洗流动测量室 准备下一个样品测定 4 免疫荧光4 1时间分辨免疫荧光 TRFIA 美国PerkinElmer芬兰Wallac新波达安基因4 2光激化学发光 Lica 博阳4 3多种技术综合美国雅培AxSYMMEIA日本东曹MEIA 化学