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文档简介

以人类某基因引物为例，Forward Primer：GGCCACACACGGAGGCAGGGA；Reverse Primer：TTATACAGGGCGTACACTTTC （反向翻译为：GAAAGTGTACGCCCTGTATAA）。简述序列比对步骤：1. 进入“NCBI”网站，点击“Blast”，进入界面：2. 点击“nucleotide blast”，进入界面：3. 在“Enter query sequence”序列输入框中输入引物序列。注意下游引物需反向翻译后输入，可只输入上游引物或下游引物，或都输入，且上下游之间可用多个空格间隔。如：GGCCACACACGGAGGCAGGGA GAAAGTGTACGCCCTGTATAA注意：输入序列后，在“Choose Search Set”的“Database”中选择“human genomic+ transcript”。若查找的是鼠类，则选第二个；若为其他，则选第三个。可在“BLAST”旁边勾选“Show result in a new window”。最后点击“BLAST”进行比对。4. Blast后出现的界面往下拉，则出现：一般为排序的第一项为特异性最高的序列，即“Query coverage”值为100%。如图中第一项为“NM 005191.3 Homo sapiens CD80 molecule（CD80），mRNA”，其中“NM 005191.3”为该序列在数据库中的ID号。界面再往下拉可看到细节，如：图中可看出上游在mRNA序列的起始点为399bp，下游的终结点为1262bp，因此上下游之间的片段大小为1262-399+1=864bp，即扩增片段为864bp。5. 点击“NM 005191.3”序列号链接可出现CD80 mRNA序列图，如：图中文字部分为该序列的基本特征及来源的参考文献、作者等信息。界面再往下拉：图中显示外显子“exon”的位置及编码序列“CDS”的位置。编码序列的描述中附有翻译的氨基酸序列，即“translation=”以后的部分。由步骤4的计算可看出引物扩增的片段即为编码序列。界面再往下拉则可看到CD80 mRNA 的全部碱基序列，全长2757bp。6. 点击“CDS”链接：界面往下拉即可看
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