流感病毒分离标准操作规程.doc

流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用，并且高度敏感的方法之一。分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。病毒可长期保存，亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。病毒分离亦受一定限制。目前用于分离病毒的组织细胞种类有限，每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。MDCK（狗肾细胞）是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。分离流感病毒最常用的活体是鸡胚，目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。由于MDCK细胞属肿瘤细胞系，故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒，不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。流感病毒细胞分离标准操作规程材料：1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶（牛胰腺来源XIII型）Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液 GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基，GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素 G; 10,000 g/ml 硫酸链霉素) ，GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液，GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养，（组织培养管也可被应用，若样本量大的话应选用培养瓶，细胞数量按规定调整。）9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备：（建议：要求经常检查试剂使用的有效期）500 ml D-MEM液中加入：青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 g/ml 链霉素)牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液：每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/ml ）使TPCK-胰酶的浓度为2 g/ml。方法：（所有有关病毒分离的操作都应在生物安全实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。进入生物安全实验室要求着必要的个人防护用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防护眼镜）程序： 细胞培养瓶的准备1、显微镜检查细胞生长状态，40倍放大。2、用病毒培养液替代细胞生长液，保证使用合适的病毒培养基。3、轻轻倒出细胞生长液于广口瓶中，用6 ml of含2 g/ml of TPCK-胰酶的D-MEM液洗细胞3遍。 细胞培养瓶的接种1、用无菌的移液管将D-MEM从细胞培养瓶中移出。2、用无菌的移液管吸取200 l临床样品置于细胞培养瓶中。3、接种物37吸附30分钟。4、加6 ml of含2 g/ml of TPCK-胰酶的不含小牛血清的完全D-MEM液于细胞培养瓶中。5、每细胞培养物的收获日检测细胞病变。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大。细胞核固缩或破裂。严重时细胞部分或全部脱落） 细胞培养物的收获1、当细胞病变为3+或4+时，收获细胞悬液并加稳定剂如：甘油或终浓度为0.5%的牛血清白蛋白。即使无细胞病变也应该于6-7天收获。2、进行红细胞凝集实验并4保存。如没有红细胞凝集现象在报告不能从样品中分离病毒前，应再传代2-3次。3、如果有必要，应3000转离心5分钟以去除剩余的细胞。通过血凝抑制实验鉴定分离物，并在收获的一天间将分离物保存在-70条件。流感病毒鸡胚分离标准操作规程材料：鸡胚10日龄照卵灯70%酒精针头, 22 号, 1 英寸1ml注射器鸡卵开孔器胶水或清漆15ml 管和架子10ml 移液管无菌镊子方法：（所有有关病毒分离的操作都应在生物安全实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。进入生物安全实验室要求着必要的个人防护用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防护眼镜）程序：I.验卵1、用照卵灯检测鸡胚，并将鸡胚的盲端放置在蛋盘上。2、如果鸡胚是没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应掉。II.鸡胚接种1、将鸡胚的盲端放置在蛋盘上，标记每个鸡胚用特定的鉴定数量（通常每个样本接种3个鸡胚）。2、用70%乙醇消毒鸡胚，在气室端钻孔。每份标本接种3个鸡胚。3、用注射器吸1ml处理过的临床标本，装上22 号（ 1 英寸）针头。4、将鸡胚置于蛋架上，用短促动作刺破鸡胚羊膜，将100 l临床标本注入鸡胚羊膜腔。将针头退出至 英寸，将另外100 l临床标本注入鸡胚尿囊腔。5、用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚。6、将针头弃于合适的生物安全装置中。7、滴石蜡或胶水封口。8、33-34温箱培养鸡胚2-3 天。提示：禽流感需35 or 37培养，哺乳动物流感病毒35培养（禽流感在35C也会生长良好！）III.鸡胚收获1、鸡胚在收获前应4过夜或至少放置4小时。2、标记15ml 塑料管与相应的鸡胚编号一致。用70%乙醇消毒鸡胚顶部。3、用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml 吸管吸鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用注射器和针头刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。由于羊水较少可以将3个鸡胚的羊水合并。4、将鸡胚收获液3000转离心5分钟去除血液和细胞。进行红细胞凝集实验并4孵育30分钟。如没有红细胞凝集现象在报告不能从样品中分离病毒前，应再鸡胚传代2次。5、如果有必要，应3000转离心5分钟以去除剩余的细胞。通过血凝抑制实验鉴定分离物，并在收获的一天间将分离物保存在-70条件下。注意事项I.不要在-20条件下保存病毒分离物，应该温度条件下流感病毒极不稳定。II.流感病毒实验室毒株和临床检测样本的交叉污染问题：流感病毒操作要求生物安全规程。当在同一工作区域内操作临床样本和已知流感病毒时应该有特殊警示。有些实验室用已知的病毒作为阳性控制，而且有将商用推荐病毒作为质量确证程序。这些病毒由于其极优的生长特性被选择出来。因此这些毒株常与临床检测样本发生交叉污染。最好在流感流行季节前准备该类病毒。如果在此期间必须补充这类病毒的话，必须与处理临床标本的时间分开。应尽量将已知病毒和未知材料在不同时间、不同生物安全柜、不同房间进行操作。III.实验室污染的鉴定：由于试验室已知毒株和商用推荐病毒都是实验室适应的，有良好的生长特性，通常滴度较高。用推荐血清做抗原分析和基因序列分析可以确定污染状况。重要原则：禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床标本和已知标准病毒。禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同动物的标本；动物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保存。由于MDCK等一些传代细胞属肿瘤细胞系，用其分离的病毒不能用于疫苗制备，故要求进行流感病毒分离时，同时采用鸡胚和MDCK细胞。 （一）MDCK细胞分离流感病毒 1、实验材料： MDCK细胞（最好是早代的）Eagle氏培养液（日本产的含谷氨酰胺的以抽滤为好）Hank氏溶液0.25%胰酶和Versene消化液双抗(青、链霉素)或庆大霉素和抗真菌素胎牛或小牛血清5.6%或7.5%的NaHCO3.（1）细胞生长液配制 90ml Eagles液+含终浓度为100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素+10ml小牛血清+2ml 5.6%NaHCO3 PH调至 7.2-7.4。（2）细胞维持液配制: 同生长液，但不含胎牛或小牛血清，而含终浓度为23ug/ml胰酶，用前用NaHC03将PH调至中性或偏碱。维持液的作用是使细胞停止繁殖，但仍保持代谢。 2、MDCK细胞传代（1）先把需用的Eagles和Versene放37水浴预温，其它试剂不得放入。（2）已成片的MDCK细胞，将其生长液倒掉。用Versene洗2遍。（3）把Versene与0.25%胰酶按71比例配成消化液。（4）置37恒温箱510min，当细胞变圆，细胞与细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成片，表明消化时间未到。 （5）倒掉消化液，瓶内留少许流体，再放37 23，取出手上轻轻拍打几下，这时可加已配好的生长液，稍加吹打即可。一般情况下，1瓶细胞传3瓶 ，每2-3天需传一代。3、MDCK细胞保存及复苏 MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加而下降，故各实验室应液氮冻存代数较低的细胞作为种子。一般保存液为含10%二甲基亚砜和90%小牛血清。（1）MDCK细胞保存：将单层细胞消化分散成为单细胞，加入0.9ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜混合保存液，每瓶加1ml保存液，缓慢冻存：先放42h，转放704h，再转放液氮中长期保存。（2）MDCK细胞复苏：细胞冻存管从液氮罐取出后，速放37水浴溶化，1500rpm/分离心1分钟，弃上清、沉渣加入若干ml培养液，混匀后加入细胞培养瓶中，置37二氧化碳温箱培养。4、MDCK细胞对流感病毒敏感性测试 MDCK细胞对病毒的敏感性随其代数增加而下降。故MDCK细胞在实验室传20代以上时，一般需测试一下其对流感病毒的敏感性。其具体测试法：选一株对MDCK细胞较敏感的流感病毒株。在同一条件下，用早代与要测试的MDCK细胞对其进行TCLD50测定。如果测试的TCLD50比早代的低2个或以上Log,表明其对病毒的敏感性已下降，不应再加以使用 。5、MDCK细胞病毒接种和收获（1）在低倍光学显微镜下检查MDCK细胞生长状态。（2）成片的细胞弃生长液，用Hanks液洗两遍，将残余的牛血清洗净，因牛血清中含有流感病毒非特异抑制素，会影响流感病毒的复制。 （3）每瓶加入接种标本0.5-1.0ml，轻摇细胞瓶，置35吸附1-2h。（4）倒掉感染液，再用Hanks液洗12遍，每瓶加入3ml维持液，置33-35培养。（5）次日起每天检查有无细胞病变（CPE）。CPE特征为细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或碎裂，严重时细胞部分或全部脱落（见附图）。（6）收获及红细胞凝集活性（HA）检查：当CPE出现+号时进行收获，由于CPE无法证实就是流感病毒所造成。最后还得看维持液中是否有红细胞凝集活性（HA），出现细胞凝集的为阳性标本， 收获所有的维持液进行病毒鉴定，也可暂冻存之 。 由于维持液中无牛血清，同时含一定量的胰酶和NaHCO3，故不应在4保存，否则易造成HA活性丢失和PH变高。维持液中加适量胰酶的目的是为了提高流感病毒在细胞中复制能力。 （7）传代及盲传：如收获的维持液HA滴度不高或量不够用于鉴定，需在MDCK细胞或鸡胚中传代，把HA滴度提高或增多。 （二）细胞培养中应注意的一些问