分枝杆菌检验

分枝杆菌是一类细长略带弯曲的杆菌，含有分枝菌酸，有分枝生长的趋势 而得名。因具有抗酸性，故又称抗酸杆菌。,第15章 分枝杆菌属,人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌对人类致病。人型结核分枝杆菌感染的发病率最高。 由于结核分枝杆菌的耐药和AIDS发病率呈上升趋势，结核病成为危胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题。 世界防治结核病日：3月24日,第一节 结核分枝杆菌,据2000年全国结核病流行病学抽样调查结果显示，我国结核病疫情现状为：（1）结核病感染率高：目前全年龄组结核菌感染率为44.5%，全国约5.5亿人受到了结核菌感染，结核菌感染率高于全球人口感染率为1/3的水平。（2）结核病患病率高：全国活动性肺结核患病率为367/10万，涂阳肺结核患病率为122/10万，菌阳肺结核患病率为160/10万；估算全国现有活动性肺结核病人数450万，其中涂阳肺结核病人150万，菌阳肺结核病人200万。,我国结核病疫情现状,（3）结核病耐药率高：肺结核病人结核菌初始耐药率为18.6/10万, 继发耐药率为46.5/10万。按照全国菌阳肺结核病人200万计算，全国有耐药病人55.5万。（4）结核病死亡率高：全国结核病死亡专率为9.8/10万,每年因结核病死亡13万人，为各种其他传染病和寄生虫病死亡总和的2倍。,全球结核病疫情现状,据世界卫生组织报道，目前全球有近1/3的人已感染结核杆菌，也就是20亿人口感染了结核菌。全球有活动性肺结核病人约2000万，每年新发结核病人约800-1000万，每年约有300万人死于结核病。结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。,上世纪末为什么全球结核病疫情回升,20世纪90年代，全球结核病疫情回升的主要原因为：（1）对结核病的忽视：由于发达国家结核病控制的效果较好，盲目乐观地认为消除结核病在望，放松了结核病控制工作，削减机构、人员和经费。而发展中国家尽管疫情严重，但无足够的力量支持结核病防治工作。（2）移民和难民增加：来自结核病流行严重地区的大量移民和难民，这些移民和难民大多数是已经感染了结核菌，发病率很高，他们的发病加重了当地的结核病的流行。,（3）人类免疫缺陷病毒（HIV）感染和艾滋病（AIDS）的流行：HIV感染降低了人体对结核菌的免疫力，使HIV感染合并结核菌感染的人迅速发生结核病。（4）多耐药结核病例增加：由于结核病人的不规律治疗，病人肺内的结核菌对多种抗结核药物发生耐药。这些病人不但治疗无效，病死率高，而且传染给其他人造成耐药性结核菌的流行。,（一）致病物质致病性-菌体成分、毒性代谢产物、炎症菌体成分：荚膜脂质蛋白质多糖、核酸等,一、临床意义,1、荚膜：荚膜的主要成分为多糖，部分为脂质和蛋白质。荚膜功能: 能与吞噬细胞表面补体受体结合，有助于此菌对吞噬细胞的粘附和侵入；,荚膜中有多种酶，可降解宿主大分子物质，作为细菌的营养；能防止有害物质及药物进入；能抑制溶酶体与吞噬体融合。,2、脂质：含量越高，致病性越强磷脂：促使单核细胞增生，使巨噬细胞转变为类上皮细胞，形成结核结节和干酪样坏死。索状因子：能破坏线粒体膜，抑制粒细胞游走和吞噬，形成慢性肉芽肿。,蜡质D：有佐剂作用，可刺激机体产生迟发型超敏反应。硫酸脑干脂：抑制溶酶体与吞噬体融合，使该菌长期存活于体内。,3、蛋白质：有抗原性，与蜡质D结合引起超敏反应，引起组织坏死和中毒症状，无保护性。4、多糖：中性粒细胞增多，致局部细胞浸润5、核酸：具有感染性,所致疾病,肺部感染原发感染 原发综合征 全身粟粒性结核或结核性脑膜炎,结核病（痨病、慢性消耗性疾病、富贵病） 传染方式：以呼吸道为主的多途径 易感人群：易感率高，发病率低,继发感染 已痊愈的原发感染可以复活成为活动性结核病。 由外界新侵人的结核分枝杆菌引起。肺外感染 经血液、淋巴液脑、肾、骨、关节等 结核 经消化道肠结核、结核性腹膜炎等 经破损的皮肤皮肤结核,（三）免疫性1、结核杆菌为胞内寄生菌，以细胞免疫为主2、结核免疫为传染免疫，有菌免疫3、细胞免疫、超敏反应、传染三者同时存在，故可通过结核菌素试验测定机体对结核有无免疫力。,形态染色：革兰染色阳性，菌体细长微弯，具有分枝生长现象，抗酸染色阳性（红色）,菌体排列分散,二、生物学特性,形态与染色 细长略弯，有时呈分枝状（14） m 0.4m无芽胞、鞭毛,有荚膜齐-尼氏抗酸染色阳性 (近年发现结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜。一般因制片时遭受破坏而不易看到。若在制备电镜标本固定前用明胶处理，可防止荚膜脱水收缩。在电镜下可看到菌体外有一层较厚的透明区，即荚膜，荚膜对结核分枝杆菌有一定的保护作用。),浓石炭酸复红,5分钟,3%盐酸酒精脱色1分钟,美兰复染1分钟,干后镜检,抗酸菌红色,非抗酸菌兰色,加热,抗酸染色（Ziehl-Neelson）,加热,使菌体表面疏松，以便染料透入,增强染液在脂质中的溶解度,具有抗酸性的机制,具有分枝菌酸，能与复红结合,细胞结构完整,石炭酸在脂质中的溶解度大,（二）培养特性1、专性需氧，营养要求较高，常用罗氏(Lowenstein)培养基。,罗氏培养基成分,甘油,马铃薯,蛋 黄,无机盐,孔雀绿,2、在液体培养基中，常出现菌膜生长，并有皱纹3、生长缓慢，菌落为粗糙型，典型的“菜花样菌落”,抵抗力,四不怕干燥酸（3% HCl或6% H2SO4) 或碱（4% NaOH) 有抵抗力碱性染料青霉素等抗生素,四怕乙醇湿热紫外线抗痨药物（链霉素、异烟肼、利福平等）,（四）变异性形态、菌落、毒力和耐药性均可发生变异。1、毒力变异：卡介苗（BCG）对预防结核起了重大作用，但因各地广泛使用及系列传代，现已发现卡介苗子代株基因组缺失16个区段。,卡介苗（BCG）：将有毒的牛型结核分枝 杆菌培养于含甘油、胆汁、马铃薯的培养 基中，经230次移种传代，历时13年而获 得的减毒活菌株，目前广泛用于人类结核 病的预防。,2、耐药性变异在2009年全球耐多药/广泛耐药结核病高负担国家部长级会议上，卫生部部长陈竺通报了中国的情况：中国目前耐多药结核的发病率为8.32%，总数约12万人。,3、L-型变异 抗酸性减弱，染色不能发现； 常规培养不能生长； 与结核的恶化、复发有关， 与耐药和肿瘤相关。,三、微生物学检验,（一）检验程序见图15-2（二）标本采集感染部位不同，采集不同的标本抑制杂菌生长标本：痰液、尿液、脑脊液等,（三）标本直接检查1、形态学检查直接涂片染色镜检 痰厚涂片，抗酸染色后，观察至少100个视野，结核分枝杆菌抗酸染色后呈红色，其他细菌和细胞为蓝色。结果应报告“找到或未找到抗酸性杆菌”，而不能报告“找到结核分枝杆菌”。,2、核酸检测 PCR法快速诊断结核分枝杆菌感染3、抗PPDIgG的检测 ELISA4、抗原检测ELISA,（四）分离培养与鉴定 1、分离培养 标本接种于选择性固体培养基中，常用罗琴培养基或青霉素血液琼脂培养基，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长，如果出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落，涂片染色为抗酸阳性，多数是结核杆菌。,2、鉴定 (1)PCR反向膜探针杂交ELISA法(PCR杂交梳) (2)DNA探针 (3)16s rRNA基因序列测定 (4)高效液相色谱(HPLC)检测,(五)药物敏感性试验 将纯培养物菌悬液，接种含各种浓度药物的固体培养基上，同时做不含药物的对照组。经过培养，含有药物的培养基上菌落数目是对照组的75以上，则认为该菌对该药物浓度为完全耐药，如无菌落生长则为敏感。,（六）免疫学诊断1、结核菌素试验 原理：纯蛋白衍生物(PPD) 注入皮内后，如果受试者已感染结核，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，形成迟发型超敏反应性炎症。,结核菌素试剂旧结核菌素（old tuberculin，OT）纯蛋白衍生物（PPD）: PPD-C、 BCG-PPD,方法：皮下注射皮肤划痕或点刺皮内注射 以后者应用最为广泛，效果准确 -分别取两种PPD 5单位注入两前臂皮内，4872小时后观察。,结果分析15mm为强阳性可能有活动性结核病红肿硬结超过5mm者为阳性PPD-C侧 BCG-PPD侧 感染PPD-C侧 BCG-PPD侧 卡介苗接种红肿硬结小于5mm者为阴性反应受试者处于原发感染的早期，T淋巴细胞尚未被致敏老年人患严重结核病或其他传染病（如麻疹等）的患者获得性免疫功能低下，如艾滋病患者或使用免疫抑制剂治疗者,应用：选择BCG接种对象及测定接种效果；诊断婴幼儿结核病；在末接种BCG的人群中作结核分枝杆菌感染的流行病学调查；测定肿瘤病人的细胞免疫功能。,第二节 非典型分枝杆菌,指结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。因具有抗酸性，故又称非典型抗酸性菌。 广泛分布于外环境和人及动物的机体中。已发现17种以上能引起人类疾病，引起肺部感染。,、光产色分枝杆菌二、暗产色分枝杆菌三、不