“分子生物学”期末复习重点.ppt

1 Copyright byARTCOMPTAllrightsreserved 分子生物学 2 绪论 证明DNA是遗传物质的两个关键性实验 肺炎链球菌在老鼠体内的毒性实验 噬菌体DNA侵染大肠杆菌实验 这两个实验主要的论点证据是生物体吸收的外源DNA 而并非蛋白质 改变了其遗传潜能 3 DNA重组技术将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来 在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达 产生影响受体细胞的新的遗传性状 主要步骤包括 目的基因的获取 化学合成 基因组文库 cDNA文库 PCR 克隆载体的选择和构建 将外源DNA连到克隆载体上 外源DNA则可作为克隆载体的一部分在受体细胞中复制 目的基因与载体的拼接 重组DNA分子导入受体细胞 电穿击法 热击法 筛选含重组分子的受体细胞 抗药性标志选择等方法 4 二 重组DNA的主要步骤 五大步骤 分 切 连 转 筛 5 第二章染色体与DNA 染色体与DNA的关系细胞内的DNA主要在染色体上 即染色体是遗传物质的主要载体 注意 染色体外遗传物质原核生物中 DNA还存在于质粒中 真核生物中 DNA还存在于线粒体 叶绿体 6 DNA的半保留复制 DNA复制时 亲代DNA双螺旋结构解开 分别以解开的两股单链为模板 以为原料 严格按照碱基配对原则合成与模板链互补的新链 从而形成两个子代DNA双链 其结构与亲代DNA双链完全一致 因子代DNA双链中的一股单链源自亲代 另一股单链为合成的新链 形成的双链与亲代双链的碱基序列完全一致 故称为半保留复制 DNA的半保留复制保证了DNA在代谢上的稳定性 7 解链酶 Helicase 拓扑异构酶 Topoisomerase 单链结合蛋白 SSB 引物酶 Primases DNA聚合酶 polymerases DNA连接酶 Ligases 原核生物DNA复制过程中有关的酶及蛋白 8 DNA的修复错配修复 恢复错配 保存母链 修正子链 碱基切除修复 切除突变的碱基 核苷酸切除修复 修复被破坏的DNA DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤 导致双链之间无法形成氢键 DNA的直接修复 9 DNA的转座 所有生物体中都有一类特殊的随机DNA序列 这些序列有特殊的能力 能够作为一个不连续单位从基因组的一个位置移动到另一个位置 这种重新定位的能力叫做转座 DNA的转座是由可移位因子介导的遗传物质重排现象 在质粒 病毒 原核生物 真核生物基因组中均有存在 可引起基因的插入突变 缺失 倒转 产生新的基因等 转座类型 复制性转座 整个转座子被复制后进行移位 非复制性转座 转座子直接被移位 转座子类型 a 插入序列 IS b 复合转座子c TnA家族 10 第三章生物信息的传递 上 RNA主要以单链存在 RNA既担负贮藏及转移遗传信息的功能 又能作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能 不对称转录 在DNA双链分子中 转录通常只在DNA的一条链上进行 另一条链则不能转录 但可能对转录起调节作用 这种转录方式称为不对称转录 11 模板识别 RNA聚合酶与启动子相互作用并相结合 原核直接识别 真核不能 需转录调控因子按特定顺序结合于启动子上 转录起始 RNA链上第一个核苷酸键的产生 生成由RNA聚合酶 模板和转录5 端首位核苷酸组成的起始复合物 通过启动子 转录起始后直到形成9个核苷酸短链 转录延伸 RNA聚合酶离开启动子 沿DNA链移动并使新生RNA链沿5 3 不断伸长 在原核生物 因为没有细胞膜的分隔 转录未完成即已开始翻译 而且在同一DNA模板上同时进行多个转录过程 转录终止 到转录终止位点时 RNA DNA杂合物分离 DNA恢复双链 RNA链释放 原核生物转录的终止分依赖 因子 强终止 与不依赖 因子 弱终止 因子是NTP酶 通过催化各种核苷酸水解来促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来 从而终止转录 不依赖 因子的终止 其RNA产物3 端往往形成茎环结构 其后又有一串寡聚U 茎环结构可使因子聚合酶变构而不再前移 寡聚U则使RNA DNA3 出现不稳定的rU dA区域 利于RNA从DNA模板链脱出 原核生物的转录过程 12 启动子 一段位于结构基因5 端上游的DNA序列 是RNA聚合酶的结合区 其结构直接关系转录的特异性与效率 原核 TTGACA 35 TATAAT 10 起始位点真核 增强子 GC 110 CAAT 70 TATAA 25 5mGpp 起始位点 13 遗传密码的特性 连续性 即从AUG开始 各密码子连续阅读而无间断 若有碱基插入或缺失 会造成框移突变 简并性 大部分氨基酸有多个密码子 以2 4个居多 可有6个 这种由多种密码编码一种氨基酸的现象称为简并性 决定同一种氨基酸密码子的头两个碱基是相同的 第三位碱基不同 第三位碱基发生点突变时仍可翻译出正常的氨基酸 摆动性 mRNA密码子的前两位碱基和tRNA的反密码严格配对 而密码第三位碱基与反密码第一位碱基不严格遵守配对规则 称为密码配对的摆动性 普遍性与特殊性 生物体的遗传密码相同 称密码的普遍性 但线粒体密码子有例外 如AUA与AUG均代表Met和起始密码子 UGA为Trp密码子而不是终止密码子等 第四章生物信息的传递 下 14 移码突变 在编码序列中 单个碱基 数个碱基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突变位点之后的三联体密码阅读框发生改变 tRNA的结构二级结构 三叶草形 受体臂 T C臂 反密码子臂 D臂 三级结构 L形tRNA的功能 解读mRNA的遗传信息 与mRNA结合部位 反密码子部位 运输工具 运载氨基酸 接受氨基酸部位 3 端CCA 形成氨酰 tRNA 15 tRNA的种类 起始tRNA 特异识别mRNA模板上起始密码子的tRNA 原核 起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸fMet 起始AA tRNA为fMet tRNAfMet 真核 起始tRNA携带甲硫氨酸Met 起始AA tRNA为Met tRNAMet 延伸tRNA 识别起始密码子以外其他密码子的tRNA 同工tRNA 携带同一种氨基酸的tRNA 要有不同的反密码子 以识别该氨基酸的各种同义密码 要有某种结构上的共同性 能被相同的AA tRNA合成酶识别 校正tRNA 能校正无义突变和错义突变的tRNA 延伸tRNA也可携带Met 但只能起将Met掺入正在延伸的肽链中的作用 16 原核和真核生物核糖体的组成及功能核糖体亚基rRNAs蛋白RNA的特异顺序和功能细菌50S23S36种 L1 L36 有能与tRNAMet互补的序列70S5S含CGAAC和GT CG互补30S16S21种 S1 S21 16sRNA CCUCCU 和S D AGGAGG 互补哺乳动物28S49种未知60S5S80S5 8S真核大亚基特有 类似原核的5SrRNA40S18S33种和Capm7G结合 17 核糖体上有多个活性中心 mRNA结合部位 SD 16sRNA 小亚基接受AA tRNA部位 A位 接受肽基 tRNA部位 P位 大亚基脱酰tRNA暂居部位 E位 核糖体的功能 18 氨酰 tRNA合成酶 一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶 催化氨基酸的活化 对其底物 氨基酸和tRNA 有高度特异性 至少存在20种以上 同一氨基酰 tRNA合成酶可将相同的氨基酸加到多个带有不同反密码子的同工tRNA上 氨基酰 tRNA的表示方法 Ala tRNAAla Ser tRNASer Met tRNAMet 19 蛋白质合成的过程及各阶段主要成分 原核 1 AA tRNA与核糖体A位点结合 2 肽键的形成 3 移位 1 N端fMet或Met的切割 2 二硫键的形成 胱氨酸 3 特定氨基酸的修饰 4 切除新生链中非功能片段 损伤蛋白质的降解依赖泛素蛋白 20 试述参与蛋白质生物合成的主要物质及各自的功能 原料20种氨基酸 模板mRNA是翻译的直接模板 运载体tRNA可和相应的氨基酸结合成氨基酰 tRNA 并借其反密码辨认 由rRNA和多种蛋白组成的核糖体是翻译的场所 蛋白因子如原核生物起始因子IF 延长因子EF 释放因子RF分别在翻译的起始 延伸和释放三个阶段发挥作用 21 SD序列 所有原核生物mRNA上都有的一个5 AGGAGG 3 富嘌呤区序列 可与30S亚基上16SrRNA3 端的富嘧啶区序列5 GAUCACCUCCUUA 3 相互补 以使转录出的mRNA能够在核糖体上进行翻译 由Shine及Dalgarno等证明 22 两类蛋白运转机制 1 翻译运转同步机制 合成和运转同时发生2 翻译后运转机制 合成并释放后才运转 23 信号肽 信号肽是未成熟的分泌性蛋白质中可被细胞转运系统识别的特征性氨基酸序列 有碱性N 末端 疏水核心区 及加工区三个区段 信号肽位于新合成的分泌蛋白N端 对分泌蛋白的靶向运输起指导和决定性作用 24 限制性内切酶 能识别DNA上特异位点并将双链切开 形成粘末端或平末端 一般能识别4 8bp 且常为回文结构 常见的有EcoR BamH Hind EcoR 等 第五章分子生物学研究技术 25 克隆载体 独立于寄主的自主复制能力 从寄主细胞中容易分离 具有选择性的标记 含有多克隆位点 表达载体 除应具有克隆载体的特点外 还必需有转录过程中需要的启动子和终止子 翻译过程中需要的完整ORF 阅读框 以及核糖体结合位点等元件 26 蓝 白斑筛选 克隆载体上带有的LacZ基因 可以编码产生 半乳糖苷酶的 肽 独立无活性 宿主细胞可以编码产生 半乳糖苷酶的另一肽段 独立无活性 当克隆载体进入宿主细胞 两片段互补结合 生成具有活性的 半乳糖苷酶 该酶在IPTG 半乳糖苷 诱导下能分解无色底物X gal 5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 产生蓝色 从而使宿主细胞形成的菌落变为蓝色 当外源DNA插入位于LacZ基因内部的MCS后 LacZ基因不能表达 重组子与宿主细胞间的 互补被破坏 不能分解X gal底物 菌落仍呈白色 从而将重组细菌筛选出来 27 细菌转化 CaCl2法转化大肠杆菌电击法转化大肠杆菌噬菌体作载体转化细菌 28 PCR技术 PCR中文名称为聚合酶链反应 是一种DNA的体外扩增技术 其基本原理是以拟扩增的DNA分子为模板 以一对分别与模板5 末端和3 末端相互补的寡核苷酸片段为引物 在DNA聚合酶作用下 按照半保留复制的机制沿着模板链合成目的DNA的过程 基本反应步骤 变性 反应系统加热至95 使模板DNA双链解离 退火 将温度下降至适宜位置 是引物与模板DNA退火结合 延伸 温度上升至72 DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA合成 29 以mRNA为模板 利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA cDNA 再复制成双链cDNA片段 与适当载体连接后转入受体菌后得到的克隆总合 含有特定细胞或组织中mRNA信息 蛋白信息 常选用 噬菌体作载体 cDNA噬菌粒文库的主要步骤为 cDNA文库 cDNAlibrary 30 SNPs 单核苷酸多态性singlenucleotidepolymorphisms 指基因组DNA序列中由于单个核苷酸替换而引起的多态性 一个SNP表示在基因组某个位点上有一个单核苷酸的变异 SNPs具有高密度和高保守的特点 是第三代多态性遗传标记 较限制性酶切片断长度多态性RFLP以及微卫星多态性应用更广 31 基因敲除技术 概念 将一个结构已知但功能未知的基因去除 或用其他序列相近的基因取代 通过对基因敲除对象的表型分析 从而推测相应基因的功能 又称基因打靶 其本质为DNA重组 分类 完全敲除 通过同源重组完全消除靶基因活性 条件型敲除 通过同源重组在某一特定细胞类型或发育的特定阶段敲除某一特定基因 32 RACE rapidamplificationofcDNAends 全称为cDNA末端快速扩增技术 是由已知cDNA片段扩增全长基因的方法 根据已知序列设计基因片段内部特异引物 由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列 用于扩增5 端的方法称为5 RACE 用于扩增3 端的称为3 RACE 33 酵母单杂交法 研究DNA与蛋白之间的相互作用酵母双杂交系统 研究蛋白质 蛋白质间相互作用 对一般原核生物的研究大多采用E coli模式 是因为 E coli生长速度快 容易保存和管理 且费用低廉 基因组小 遗传背景已经非常清楚 34 RNA干涉 RNAinterference 简称RNAi 双链RNA dsRNA 进入细胞后特异高效降解细胞内同源mRNA 从而阻断体内靶基因表达 使细胞出现靶基因缺失的表型 引发转录后基因静默机制 RNAi的机制可能是双链RNA进入细胞后 在Dicer酶的作用下 被切割成21 23bp大小的小分子干扰RNA片段 siRNAs siRNAs结合一个核酶复合物从而形成RNA诱导沉默复合物 RISC 激活的RISC可以精确降解与siRNAs序列相同的mRNA 完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达 35 双向电泳 Twodimensionelectrophoresis 2 D 双向电泳依赖于蛋白质的两个重要特性 等电点不同 相对分子质量不同 双向电泳由两部分构成 第一向 等电聚焦 IEF 第二向 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 分辨率 蛋白点 胶 16cm 20cm 36 第六章原核基因的表达调控 操纵子 指数个功能上相关的结构基因串联在一起 连同其上游的调控区 包括启动子和操纵基因 以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位 所转录的RNA为多顺反子 可诱导调节 可阻遏调节 组成性表达 适应性表达 37 乳糖操纵子模型乳糖操纵子包括三个结构基因 Z Y A 三个调节序列 启动序列 操纵序列和CAP蛋白结合位点 以及一个调节基因 调节基因编码阻遏蛋白 阻遏蛋白的负性调节 蛋白质与DNA结合抑制基因的转录属于负性调节 操纵序列是控制操纵子中结构基因转录的开关 阻遏蛋白与操纵序列结合可阻止RNA聚合酶对结构基因的转录 当乳糖存在时 乳糖的分鲜产物半乳糖与阻遏蛋白结合 导致阻遏蛋白与操纵序列解离 诱导基因的转录 CAP的正性调节 蛋白质与DNA结合增强基因转录属于正性调节 在启动子上游子存在CAP结合位点 CAP与其结合后可促进RNA聚合酶与启动秀列结合 从而促进转录 但是 CAP单独不能与其位点结合 只有与cAMP形成复合物后才能与CAP位点结合 细胞内葡萄糖缺乏时 cAMP水平升高 cAMP CAP复合物形成并与CAP结合位点结合 促进RNA聚合酶与启动序列结合并启动转录 葡萄糖丰富时 cAMP水平降低 cAMP CA P复合物不能形成 P不能与DNA结合 不能启动转录 协调调节 即阻遏蛋白的负性调节与 蛋白正性调节的协同作用 当阻遏蛋白与操纵序列结合封闭转录后 不能启动转录 但是阻遏蛋白脱离操纵序列而解除封闭后 如果没有 的作用也不能启动转录 所以乳糖操子的诱导作用即需要乳糖的存在又需要葡萄糖的缺乏 38 组成性基因表达 某些基因产物对生命全过程是必需的或必不可少的 这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达 通常被称为管家基因 较少受环境因素影响 而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达 或变化很小 弱化子 衰减子 在色氨酸操纵子中 当mRNA合成起始以后 除非培养基中完全没有色氨酸 否则 转录总是在长162bp的前导区终止 产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子 终止trp基因转录 因为转录终止发生在这一区域 并且这种终止是被调节的 这个区域被称为弱化子 弱化子广泛存在于细菌其他氨基酸合成系统的许多操纵元中 如组氨酸 苏氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 苯丙氨酸等操纵元 39 gal操纵子的两个启动子S1和S2ara操纵子 araBAD和araC基因的转录分别在两条链上以相反方向进行 araBAD从PBAD向左转录 而araC从PC向右转录 调节基因的产物araC蛋白同时显示正 负调节因子的双重功能 40 第七章真核基因的表达调控 DNA水平上的调控 活性染色质的形成 基因丢失 扩增 重排 转换 转录水平上的调控 RNA加工水平上的调控 转运调控 翻译水平上的调控 蛋白质水平上的调控 mRNA选择性降解的调控 41 基因家族 定义 来源相同 结构相似 功能相关的一组基因 基因家族的成员可以串联排列在一起 如 rRNA基因家族 tRNA基因家族 组蛋白基因家族等 也可位于同一染色体的不同部位上 也可位于不同的染色体上 如 珠蛋白基因家族 干扰素基因家族 生长素基因家族等类型 简单多基因家族 rRNA基因家族 复杂多基因家族 组蛋白基因家族 发育调控的复杂多基因家族 人珠蛋白基因家族 42 内含子早期定义为核酸上的非编码序列 随着内含子功能的被拓宽 建议用 转录初级产物上通过拼接作用而被去除的RNA序列或基因中与这种RNA序列相对应的DNA序列 较全面 真核生物基因中的非蛋白质编码序列 高等真核生物的大部分DNA是不编码蛋白质的 43 甲基化酶 日常型甲基转移酶在甲基化母链指导下 催化半甲基化的DNA双链上与mC对应的C甲基化 从头合成型甲基转移酶不需要甲基化母链指导 直接催化未甲基化CpGmCpG 44 真核基因在转录水平上的调控多数是通过顺式作用元件和反式作用因子复杂的相互作用来实现的 顺式作用元件 影响自身基因表达活性的 能够被基因调控蛋白特异性识别和结合非编码DNA序列 包括启动子 上游启动子元件 增强子 加尾信号和一些反应元件等 组成基因转录的调控区 反式作用因子 能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上 参与调控靶基因转录效率的蛋白质 包括 TF D TATA CTF CAAT HSF SP1 GGGCGG 等 45 反式作用因子的三个功能结构域 DNA识别结合域 转录活性域 其他蛋白的结合域 46 反式作用因子中DNA识别结合域 螺旋 转折 螺旋 Helix turn helix H T H 锌指结构 zincfinger 碱性 亮氨酸拉链 basic leucinezipper bZIP 碱性 螺旋 环 螺旋 basic helix loop helix bHLH 同源域蛋白 homeodomainsprotein 47 转录活化结构域 由DNA识别结合域以外的30 100个氨基酸组成 其特征为 带负电 富含谷氨酰胺 富含脯氨酸 48 根据底物蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类分 丝氨酸 苏氨酸型 Ser Thr 酪氨酸型 TPK 双重底物特异性蛋白激酶型根据是否有调节物参与蛋白激酶活性分 信使依赖型胞内信使或调节因子依赖型激素或生长因子依赖型非信使依赖型 49 Ser Thr型蛋白激酶酶的激活依赖于第二信使cAMP Ca2 cGMP IP3 DAG等的调节 依此特性可分为四种类型 依赖cAMP的蛋白激酶 PKA 依赖Ca2 磷脂的蛋白激酶 PKC 双信使途径依赖Ca2 钙调蛋白的蛋白激酶 CaMK 依赖cGMP的蛋白激酶 PKG 50 蛋白酪氨酸激酶 PTK 一组催化酪氨酸残基磷酸化的酶 通过从三磷酸腺苷上转移一个磷原子到酪氨酸残基上 而使底物蛋白活化参与细胞的信号转导 最终这些信号转导入细胞核内 引起某些基因表达水平的改变 使诸如细胞生长之类的复杂的细胞功能得以调节 在调节细胞的分化 生长和激活中起到重要作用 有受体型和非受体型PTK两大类 其PTK活性受胞外结构域与配体的调节 51 应答元件 能与某个 类 专一蛋白因子 转录因子结合 从而控制基因特异表达的DNA上游序列 大多位于转录起始位点上游200bp之内 但距离不固定 如HSE位于启动区内 GRE则位于增强子区内 如 热激应答元件 HSE 糖皮质应答元件 GRE 金属应答元件 MRE 血清应答元件 SRE 热激蛋白诱导的基因表达 52 癌基因 是指能在体外引起细胞转化 在体内诱发肿瘤的基因 包括病毒癌基因和细胞癌基因 二者都来自细胞原癌基因 抑癌基因 一类抑制细胞过度生长 繁殖 从而抑制肿瘤形成的负调节基因 它与调控生长的原癌基因协调表达以维持细胞正常生长 增值和分化 丢失或失活后不仅丧失抑癌作用 也可能变成具有促癌作用的癌基因而导致肿瘤的发生