罗非鱼眼透明质酸的提取。纯化及抗氧化性研究

罗非鱼眼透明质酸的提取、降解及抗氧化性研究,报告人：陈 辉,研究背景及意义 罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析 罗非鱼眼透明质酸的降解研究 低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究,目 录,研究背景,我国是世界最大的罗非鱼生产国，发展势头迅猛， 2000年的产量为62.9 万吨，2010 年增加到133.2 万吨， 2012年达到145万吨，占世界罗非鱼总产量的38.30%，位列世界前位；罗非鱼的加工产品主要为冻鱼片，其加工过程中产生的下脚料多达50%60%，这些下脚料大多被废弃，少量被加工成廉价的饲料，不仅造成损失也给环境带来污染。,研究背景及意义,罗非鱼眼含有丰富透明质酸，具有较大的研究价值，透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种糖胺聚糖，其具有独特的黏弹性和生理功能， 广泛用于医学、食品、化妆品等领域。,研究背景及意义,研究现状,1.HA的主要制备方法组织提取法 用于提取HA的动物组织主要有玻璃体、人脐带、鸡冠、蛋壳膜、蛙皮、关节滑液、软骨、鸡胚等。,研究背景及意义,微生物发酵法： 用于生产的菌种主要有兽疫链球菌(C群)、马疫链球菌(C群)、类马链球菌(C群)、缺乳链球菌(C群) 。,研究背景及意义,研究意义,罗非鱼产业加工下脚料量大、利用率低、污染环境，还在一定程度上增加了产品的成本，如何更好地利用这部分资源，提高罗非鱼原料的附加值，是罗非鱼产业急需解决的问题。 本课题从提高罗非鱼原料利用率出发，开展从罗非鱼眼提取透明质酸制备高抗氧化活性透明质酸的研究。,研究背景及意义,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,研究要点,1 透明质酸的提取纯化2 透明质酸的特性分析,研究背景及意义 罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析 罗非鱼眼透明质酸的降解研究 低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究,IEC,乙醇 沉淀,1 HA提取工艺流程图,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,2 结果与分析,2.1 单因素试验：选取酶种类、酶用量、酶水解时间、超声波处理时间和超声波功率进行单因素实验，以透明质酸的得率为参考指标分别考察该五种因素对HA提取的影响，结果如下：,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,酶解时间,酶用量,增加酶的用量，HA的得率也随之增加，酶用量达到7500 Ug-1时HA的得率最大,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,随着酶作用时间的增加HA的得率呈现先上升后下降的趋势，在第5 h达到最大值,酶种类对HA的提取效果有较大影响，其中胰蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶提取效果较好,酶种类,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,超声功率,逐渐增加超声波的功率，HA的得率也随之增加，200 W时达到最大值,超声时间,随着超声时间的增加HA得率先上升后下降，当时间达到15 min时HA的得率最高,2.2 正交实验：为进一步考察酶解条件对透明质酸提取效果的影响，根据单因素实验的结果在不改变超声波的功率及超声处理时间的前提下，以透明质酸的得率为参考指标考察酶解温度、时间、pH、酶用量对透明质酸提取的影响，因素与水平见表1：,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,2.3 纯化：,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,HA离子交换层析洗脱曲线,HA紫外光谱,HA红外光谱,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,HA的质量参考指标,1. HA的最优工艺条件为：超声波功率200 W、超声处理15 min、复合酶（胰蛋白酶和复合蛋白酶的酶活力比1: 1的混合物）、酶解3 h、酶解温度40 、pH 9.0、酶用量6000 Ug -1，利用最佳工艺条件提取透明质酸的得率为11.44%。2. 本工艺主要采用CTAB络合法、离子交换层析法、透析及超滤对透明质酸粗品进行纯化，其纯度达到97.47%，紫外图谱在260 nm、280 nm波长处无紫外吸收，红外光谱图和标准品一致。,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,罗非鱼眼透明质酸的降解研究,研究要点,1 透明质酸的降解工艺的优化2 低分子量透明质酸的特性分析,本研究比较了微波降解法、H2O2结合Vc降解法、微波结合H2O2+Vc降解法对透明质酸降解的影响，主要参考指标为LMWHA相对分子量以及葡萄糖醛酸含量的变化。,罗非鱼眼透明质酸的降解研究,罗非鱼眼透明质酸的降解研究,罗非鱼眼透明质酸的降解研究,罗非鱼眼透明质酸的降解研究,降解温度,随着温度的升高HA的相对分子量迅速降低，当温度升到60 时下降趋势趋于迟缓。,H2O2：Vc,随着H2O2和Vc的比例降低HA的分子量逐渐下降，当二者之间的比例为1: 1时达到最小值。,二、 降解工艺的优化：,罗非鱼眼透明质酸的降解研究,降解 pH,pH4时，HA的降解效果最好，pH偏离4时，体系降解能力开始下降，pH越大降解能力越差,罗非鱼眼透明质酸的降解研究,红外光谱,LMWHA和HA的红外吸收光谱一致，降解未对HA的基本结构造成较大影响,小 结微波结合H2O2+VC降解工艺的最佳条件为：温度60 、H2O2: Vc为1: 1、H2O2的添加量为24 mmolL-1、降解pH4，30 min，降解得到的HA相对分子量小于2 KDa，可根据需要改H2O2: Vc、 H2O2添加量、pH制备特定分子量LMWHA。LMWHA葡萄糖醛酸含量34.96%，略低于HA；其红外光谱与HA类似，说明该工艺对透明质酸的基本结构未造成破坏；紫外光谱260 nm处出现微弱吸收，该吸收可能缘于降解产生的不饱和键，总体来看该降解工艺对HA结构破坏较小，是一种良好的降解HA的方法。,罗非鱼眼透明质酸的降解研究,低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究,研究要点,1低分子量透明质酸的制备2低分子量透明质酸的抗氧化性研究,二、 LMWHA的制备：,低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究,二、 LMWHA的结构分析：,红外光谱,低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究,LMWHA1的还原力远大于后三者，在不同的浓度下均差异性显著（P0.05）,DPPH,LMWHA1的清除效果最好，明显大于其他三者，各浓度条件下均差异性显著（P0.05）,还原力,还原力,还原力,二、 LMWHA的体外抗氧化研究：,低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究,不同分子量大小的LMWHA均有较强的清除羟自由基的能力，且清除能力差异性较小，差异性不显著（p0.05）,OH,低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究,低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究,利用微波结合过氧化氢+抗坏血酸法降解罗非鱼眼透明质酸，制备不同相对分子量的LMWHA，并通过红外光谱、紫外光谱分析其结构变化。通过研究LMWHA对OH 、DPPH自由基的清除作用以及还原力来考察LMWHA的抗氧化能力。结果显示，随着LMWHA分子量的减小其对DPPH的清除率以及还原力增大，而对OH的清除率减小，这种差异可能与LMWHA清除自由基的机理有关。,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,总 结,最佳的工艺条件为：超声波功率200 W、超声处理15 min、复合酶（胰蛋白酶和复合蛋白酶的酶活力比1:1的混合物）、酶作用3 h、温度40 、pH 9.0、酶用量6000 Ug-1，利用此工艺条件提取HA得率为11.44%；通过CTAB络合、超滤、透析以及HiTrapTM DEAE FF 离子交换柱层析法对HA粗品进行纯化，最终产品纯度为97.47%，紫外图谱在260 nm、280 nm处无吸收，表明样品中无蛋白质和核酸等杂质；利用粘度法测量知透明质酸相对分子量大小为100 KDa，红外光谱图显示其吸收峰和标准品基本相同；,总 结,总 结,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,利用粘度法测量知透明质酸相对分子量大小为100 KDa，红外光谱图显示其吸收峰和标准品基本相同；微波结合过氧化氢+抗坏血酸法降解HA的工艺条件为： 温度60 、H2O2: Vc为1: 1、过氧化氢的添加量为24 mmolmL-1、pH 4、30 min，最终可得到LMWHA相对分子量小于2 KDa；由LMWHA的红外光谱和紫外光谱可知，该降解工艺对HA的结构破坏较小；,罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析,利用微波结合过氧化氢+抗坏血酸法制备分子量分别为小于5 KDa、510 KDa、1030 KDa、3060 KDa的LMWHA，体外抗氧化实验发现随着LMWHA分子量的减小其对DPPH的清除率以及还原力增大，而对OH的清除率减小。其原因可能是LMWHA清除DPPH以及还原力的大小依赖于其糖环上双键的数量，而清除OH能力大的大小则依赖于LMWHA链上羟基以及其螯合过渡金属离子的能力。,本研究优化了罗非鱼眼透明质酸的提取、纯化以及降解工艺，并比较了对不同分子量LMWHA的抗氧化能力，初步分析了其抗氧化机理，为罗非鱼眼HA的实际应用提供了一定的理论基础和技术支撑，由于时间和条件所限，今后的研究工作可以从以下几方面开展：研究时发现罗非鱼眼玻璃体含有较多蛋白，可对这些蛋白进行研究，以增大罗非鱼眼应用价值；本文对LMWHA抗氧化机理的研究还不够深入，其确切 机理还需要进一步的探讨；进一步开展水产品透明质酸在食品、化妆品、医药等方面的研究，扩大其应用价值,发表论文4篇，出刊1篇，3篇在投，专利一篇,1.陈辉, 于刚, 高瑞昌，等. 水生生物来源透明质酸的生化特性及其制备的研究进展J. 食品工业科技, 2013, 9(34): 364-367;2.陈胜军，陈辉，高瑞昌，等. 超声波辅助酶解法提取罗非鱼眼透明质酸工艺条件的研究J. 核农学报, 已修回定稿，待刊；3.罗非鱼眼透明质酸的降解研究J. 中国食品学