《生物传感器》PPT课件.ppt

生物传感器 中国科学院研究生院姚鑫 E mail yaox 学习这门课的目的通过本课程的学习 了解各类生物传感器的基本原理 特点 技术方法和应用 了解生物传感器的及发展趋势 为以后从事相关领域研究打好基础 参考书张先恩主编 生物传感器 化学工业出版社 北京 2006布莱恩R 埃金斯著 罗瑞贤等译 化学传感器与生物传感器 化学工业出版社 北京 2005 几个生物传感器的例子 DNA 表面等离子激元共振仪 SPR 多肽 电化学 DNA 电化学 PNA DNA SPR 葡糖淀粉酶 支链淀粉 酶 石英晶体微天平 Figure2 A TimecoursesoffrequencychangesoftheamylopectinimmobilizedQCM respondingtotheadditionofglucoamylaseat a 16 b 27 c 38 and d 54nM Thecurve e showsthehydrolysisofthepullulan immobilizedQCMat540nMglucoamylase 25 C 20mMacetatebuffer pH4 8 0 1MNaCl 传感器传感器 是一种装置 是检测或测量一种物理性质并进行记录 显示或以其他方式作出响应 第一章绪论 分析生物技术的一个重要领域便是生物传感器 biosensor 它是一个典型的多学科交叉产物 结合了生命科学 分析化学 物理学和信息科学及其相关技术 能够对所需要检测的物质进行快速分析和追踪 生物的基本特征之一 是能够对外界的各种刺激作出反应 其所以能够如此 首先是由于生物能感受外界的各类刺激信号 并将这些信号转换成体内信息处理系统所能接收并处理的信号 例如 人能通过眼 耳 鼻 舌 身等感觉器官将外界的光 声 温度及其它各种化学和物理信号转换成人体内神经系统等信息处理系统能够接收和处理的信号 生物传感器的出现 是科学家的兴趣和科学技术发展及社会发展需求多方面双驱动的结果 经过30多年的发展 已经成为一个涉及内容广泛 多学科介入和交叉 充满创新活力的领域 1 1生物传感器的发展历程 20世纪60年代酶法分析 专一性强 灵敏度高 操作简便 但是测定周期长 离子选择电极 ionselectiveelectrode ISE 操作简单 无需对样品进行欲处理 无试剂分析 non reagentalanalysis 但是只能检测无机离子 1956LelandC ClarkJnr隔离式氧电极1962LelandC ClarkJnr酶传感器 enzymetransducer 1967S J Updike葡萄糖酶电极1975YellowSpringsInstrument YSI 葡萄糖测定仪1975C Divis用完整活细胞取代纯酶制作传感器1977GA Rechnitz用粪便链球菌完整活细胞与氨敏电极组合成测精氨酸的微生物电极1977IsoKarube和J Janata测BOD的微生物传感器和测抗原的免疫传感器 随后出现了细胞器传感器 细胞传感器和组织切片传感器20世纪70年代中期到80年代 生物技术 生物电子和微电子学不断地渗透 融合 致使生物传感器不再局限于生物反应的电化学过程 而是根据生物学反应中产生的各种信息 如光效应 热效应 场效应和质量变化等 了设计各种精密的探测装置 1974K Mosbach热生物传感器1974Janata酶场效应晶体管1980D W Lubbers和N Optiz酶光纤传感器1983Giulbault压电晶体酶传感器1976A H Clemens等报道了以葡萄糖酶电极为基础的第一个人工肾脏 随后被Miles公司开发成生命稳定系统Biostator 用于重症糖尿病人床边监护 1983B Liedberg利用表面等离子激元共振 SurfacePlasmonResonance 方法 能够适时的对生物亲和反应进行检测 在次基础上 瑞典Pharmacia公司在1990年推出商用仪器BIAcore 成为目前研究生物分子之间互相作用最优秀的实验工具 1984A E G Cass首次建立了介体酶电极方法 利用化学介体戊二醛取代分子氧作为氧化还原酶酶促反应的电子受体 促成了1987年美国MediSene公司开发成功印刷酶电极 发展迅速 文章方面 webofscience中输入 biosensor 共检索到10035篇文章 约从1993 2006年 功能方面 活体 invivo 测定 多指标测定和联机在线 online 测定 检测对象 各种常见的生物化学物质 在临床 发酵 食品 化工和环保等方面均显示了广泛的应用前景 1984华盛顿召开的国际生物工程年会上将生物传感器列为当代生物工程的重要领域之一1985Elsevier科学出版公司创刊 生物传感器 国际学术期刊 1990更名为 生物传感器和生物电子学 Biosensors Bioelectronics 1987德国Dusseldor召开以生物传感为4个主题之一的BIOTECH 87 表1 1历届世界生物传感器学术大会的主题内容及其论文数量 生物传感器发展阶段 20世纪60 70年代 起步阶段 传统酶电极 20世纪70年代末期到80年代 发展高潮阶段 介体酶电极 20世纪90年代以后 市场开发获得显著成绩 生物亲和传感器的技术突破 SPR 酶的直接电化学 1 2生物传感器的原理和特点 图1 2生物传感器传感原理 生物敏感膜 biosensitivemembrane 又称分子识别元件 molecularrecognitionelement 是生物传感器的关键元件 直接决定传感器的功能和质量 表1 2生物传感器的分子识别元件 这里所说的膜是采用固定化技术制作的人工膜而不是天然的生物膜 细胞膜 表1 3生物学反应信息和换能器的选择 换能器的作用是将各种生物的 化学的和物理的信息转化成电信号 生物传感器的主要特点1 多样性 根据生物反应的特异性和多样性 理论上可以制成测定所有生物物质的酶传感器 2 无试剂分析 除了缓冲液以外 大多数酶传感器不需要添加其它分析试剂 3 操作简单 快速 准确 易于联机 4 可以重复使用 连续使用 也可以一次性使用 1 3生物传感器的基本概念与类型 基本概念 生物传感器概念来源于Clark关于酶电极的描述 关键是传感器的构成中分子识别元件为具有生物学活性的材料 首届世界生物传感器学术大会 Biosensor s90 上将生物传感器定义为由生物活性材料与相应的换能器的结合体 能测定特定的化学物质 主要是生物物质 而将能用于生物参量测定但构成中不含生物活性材料的装置称为生物敏 biosensing 传感器 Turner教授定义为 生物传感器是一种精致的分析器件 它结合一种生物的或生物衍生的敏感元件与一只理化换能器 能够产生间断或连续的数字电信号 信号强度与被分析物成比例 图1 3生物传感器分类 类型 图1 3生物传感器分类 类型 根据生物传感器的特性还有其他的命名或分类 对于个别生物传感器的命名 一般采用 功能 构成特征 的方法 比如 葡萄糖氧化酶电极 谷氨酸脱氢酶电极 BOD微生物电极 葡萄糖酶光纤传感器等 1 4生物芯片 生物芯片 biochip 芯片实验室 分析生物芯片 labonchip analyticalbiochip 图1 4生物芯片基本类型 生物计算机芯片的出现源于对传统的硅芯片计算机的发展前景的忧虑 生物计算机20世纪80年代中期开始研制 最大的特点是采用了生物芯片 生物芯片由基因技术产生的 智能 蛋白质分子构成 在这种芯片中信息以波的形式传播 其运算速度比当时最好的计算机快10万倍 能量消耗仅相当于普通计算机的1 10 拥有巨大的储存能力 能自动修复芯片发生的故障 分析生物芯片伴随人类基因组计划的诞生和发展 解码含大约30亿个核苷酸的人类基因组 需要强大的DNA序列分析能力 DNA序列分析方法迄今都基于英国剑桥大学Sanger教授的酶法 1989E Southern专利 分析多聚核苷酸序列 描述了如何在固相载体 如玻片 上通过DNA杂交来对样品DNA序列进行测定 称为杂交测序 sequencingbyhybridization SBH 此方法可以用于点突变分析 基因组指纹 连接分析 mRNA表征 mRNA类群分析和核酸序列分析 1988AndreiD Mirzabekov论文 利用寡核苷酸对DNA测序的新方法 1991改良杂交测序芯片 这些早期的报道开创了基因芯片研究领域 图1 5DNA芯片的应用领域 从SCI Expanded和CCR Expanded数据库统计 截止2004年4月共294篇 芯片实验室是另一类生物芯片 有时被称为主动式生物芯片 科学家们试图将生物化学分析的整个过程缩微到芯片上 通过微细加工工艺制作的微滤器 微分离器 微反应器 微泵 微阀门 微电极等 实现对生物样品从制备 分离 生化反应到检测和分析的全过程 从而极大地缩短检测时间和分析时间 并节省实验材料 生物芯片是一类在微小基片上 利用微加工技术 生物技术或化学合成技术制作的具有一定分析 检测 储存或计算功能的微型生物器件 1 5生物传感器的商品开发 1 5 1市场值2001 2003全球生物传感器销售额50亿美元2003全球生物传感器销售额73亿美元 应用领域包括医学 生物防范 食品与饮品 环境 生物 药物研究 2007全球生物传感器的市场总值将达108亿美元商品化的生物传感器主要有5种类型 酶电极生化分析仪BOD测定仪手持式血糖测定仪SPR分析仪各类生物芯片 1 5 2酶电极生化分析仪1972 1975年美国YellowSprings仪器公司在Clark酶电极的基础上研制出第一个商品葡萄糖分析仪 YSIGlucoseAnalyerModel 23 YS2300乳酸分析仪YS2700SELECTTM系列生化分析仪YS2710自动分析24份样品YS2710在线分析 onlineanalysis 1 5 3手持式血糖测定仪1987年英国MediSense公司开发出第一个手掌型和笔型血糖测定仪ExacTechTM我国有30种手持式血糖测定仪 年销售额已近10亿美元 1 5 4SPR分析仪1990年瑞典Pharmacia公司基于SPR生物传感器原理的生物分子相互作用开发BIACore分析仪 1 6发展趋势1 电化学生物传感器和光生物传感器 荧光 生物发光和化学发光 两类传感器占主流 2 上升趋势型 生物芯片 分子印迹 模拟传感器 表面等离子体 SPR 生物传感器稳定发展型 光生物传感器和压电生物传感器 下降趋势型 热生物传感器报道很少 电化学生物传感器的比例下降3 2003 2004年发表论文数量顺序 电化学生物传感器 光生物传感器 生物芯片 压电生物传感器 半导体生物传感器 表面等离子体生物传感器 热生物传感器另外 分子生物学和基因工程方法在生物传感器研究中逐步获得应用生物传感器的发展趋势 1 更加灵敏 准确 快速和简便是分析科学技术发展趋势的共同特征 2 生物芯片使高通量 多参数的同步测定成为可能3 挑战性需求包括体内测定 细胞内测定 单分子分析 在线测定等 为了满足这些要求 基因技术 纳米技术 各种单分子荧光技术 仿生技术或生物模拟技术得到发展 生物体本身就是各种精巧生物传感器的汇集体 其结构的精密程度和完善的功能都是迄今任何人工传感器所不能比拟的 美国OakBridge国家实验室提出感知化学和生物试剂的生物报告 bioreporter 技术 其基本原理是将能够产生光学信号或其他信号的报告基因与启动子promoter顺序克隆 当细胞环境中有被分析物存在时 细胞启动子受激启动报告基因的转录 然后利用细胞的整套翻译机制译成报告蛋白质 并产生可以检测的信号 图1 7完整细胞或生物体传感过程模式图解当生物体与特异的分析物接触时 启动子 报告基因复合物被转录成信使RNA mRNA 然后翻译成报告蛋白质 最终形成响应信号 在生物传感发展进程中 我们只不过刚刚结束在黑暗中摸索 开始在阳光下耕作沃土 Clark 第二章分子识别元件及其生物反应基础 2 1概述生物传感器的分子识别元件又称敏感元件 主要指来源于生物体的生物活性物质 包括酶 抗原 抗体和各种功能蛋白质 核酸 微生物细胞 细胞器 动植物组织等 当它们用作生物传感器的敏感元件时 都无一例外地具有对靶分子 待检测对象 特异的识别功能 本章主要内容 酶反应微生物反应免疫学反应核酸反应催化抗体催化核酸生物反应中伴随着发生的物理量变化 2 2酶及酶反应2 2 1酶反应基本概念一 酶的定义酶 enzyme 是细胞产生的 以蛋白质为主要成分 能加快反应速率 并且具有催化专一性的生物催化剂 酶是活细胞产生的一类具有特殊三维空间构象的功能化蛋白质 生物体内代谢过程中发生的化学反应绝大多数是在酶的催化下进行的 酶的存在是在生物体进行新陈代谢的必要条件 酶具有催化剂的共性 可以降低生化反应的活化能 使活化分子数大大增加 故少量的酶即可大大加快反应的速度 只改变反应速度而不改变反应的平衡点 即酶加速达到平衡而不改变平衡的位置 它不能催化热力学上不能进行的反应 酶参加生化反应前后无变化 故可重复使用 因而具有化学放大的功能 二 酶的蛋白质性质 酶都是蛋白质 或者以蛋白质为主要成分 主要证据 蛋白质是氨基酸组成的 而酶的水解产物都是氨基酸 酶也是由氨基酸组成的 酶具有蛋白质所具有的颜色反应 一切能使蛋白质变性的因素 如热 酸 碱 紫外线等 同样可以使酶变性失活 酶同样具有蛋白质所具有的大分子性质 如不能透过半透膜 可以电泳 并有一定等电点 三 酶的催化性质酶是生物催化剂 与一般催化剂相比较有如下特点 1 高度专一性 specification 或称特异性 一种酶 一种底物 2 催化效率高 以分子比为基础 其催化效率是其他催化剂的107 1013倍 3 酶是蛋白质 遇高温 酸碱容易失活 酶催化一般在温和条件下进行 4 有些酶 如脱氢酶 需要辅酶或辅基 若辅助成分除去 则酶不表现催化活性 5 酶在体内的活力常常受多种方式调控 包括基因水平调控 反馈调节 激素控制 酶原激活等 6 酶促反应产生的信息变化有多种形式 如热 光 电 离子化学等 四 酶的分类与命名1955年 国际酶学委员会 InternationalCommissiononEnzymes EnzymeCommission EC 成立 解决酶的命名问题 1964年 EC定了酶分类的标准 按照酶的催化反应类型 将酶分为六大类 1 氧化还原酶类 oxidoreductases A 2H BA B 2H包括氧化酶 过氧化物酶 脱氢酶等2 转移酶类 transferases 催化某一化学基团从某一分子到另一分子A B CA B CB为被转移的基团 如磷酸基 氨基 酰胺基 包括转氨酶 转甲基酶等3 水解酶类 hydrolases 催化水解反应 在底物特定的键上引入水的羟基和氢A B H2OAOH BH包括肽酶 即蛋白酶 水解肽键 酯酶 水解酯键 糖苷酶 水解糖苷键 等4 裂合酶类 lyases 催化C C C O C N 或C S键裂解或缩合ABA B如脱羧酶 碳酸苷酶 5 异构酶类 isomerases 使底物分子内发生重排AA 6 合成酶类 ligases 或称连接酶类 它催化两个分子的连接 并与腺苷三磷酸 ATP 的裂解偶联 同时产生腺苷单磷酸 AMP 和焦磷酸 PPi A B ATPAB AMP Ppi如氨基酸激活酶类在每一大类中都有若干亚类 每个亚类可再分成若干亚亚类 每个亚亚类包括若干种具体的酶 每一种酶在国际系统分类中的位置用特定的四个数字组成的编号表示 酶学编号 ECnumber 由4个数字构成 如脂肪酶 甘油酯水解酶 的系列编号为 EC3 1 1 3 表示第三大酶类 水解酶 第一亚类 水解发生在酯键 第一亚亚类 羟基酯水解 甘油酯水解酶 五 酶量表示法酶活力单位用国际单位 InternationalUnit IU 表示 一个酶活力单位指在特定条件下 如25 pH及底物等其他条件采用最佳条件 在1min能转化1 mol底物分子的酶量 单位为IU 酶比活力 specificactivity 指1mg酶所具有的酶活力 一般用IU mg表示 比活性高 说明酶的纯度高 酶含量指每克或每毫升酶制剂含有的活力单位数 即IU g或IU ml 2 2 2酶的作用机理一 降低反应活化能酶的构象对底物分子显示分子识别能力 可作为一种催化剂 加速反应的进程 这样的反应称为酶促反应 酶可以使反应至少加速100万倍 酶对应的加速是通过酶与底物结合形成复合物以降低反应的活化自由能实现的 这种复合物的形成为反应提供了一条新的途径 它的过度态能量要比没有酶条件下相应所需要的能量低的多 图2 1酶对反应活化能的影响无酶掺入是活化能为G1 酶催化时降为G2 但反应的自由能变化 G保持不变 B为反应生成产物分子的能量状态 A初态 initial A 活化态 过度态 transitionstate G1活化能 energyofactivation 活化能 在一定温度下 1mol底物全部进入活化态所需要的自由能F freeenergy 单位是J mol 酶的高效催化活性来源于以下几个方面 1 张变 扭曲效应 进行酶反应时 底物先与酶形成酶 底物复合物 由于互补不甚精确 从而导致底物产生某种张变 扭曲 使基态底物转变为过度态构象 降低活化能 加快反应速度 2 酸碱催化 酶分子中具有各种酸性或碱性氨基酸侧链 酸碱催化通过瞬时向反应物提供质子或从反应物中汲取质子 以稳定过渡态 加速反应 3 亲核 亲电子催化 在催化时 亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用底物的缺电子中心或负电中心 迅速形成不稳定的共价复合物 降低反应自由能 加速反应 4 多元催化和协同效应 酶分子是一个拥有多种不同侧链基团组成活性中心的大分子 这些基团在催化过程中根据各自的特点发挥不同的作用 而酶的催化作用则是一个综合结果 是通过这些侧链基团的协同作用共同完成的 二 结构专一性酶催化的专一性是由酶蛋白分子 尤其是分子中的活性部分 结构特性决定的 三 酶的辅助因子 co factor 酶需要辅助因子才能行使催化功能 辅助因子包括金属离子和有机化合物 它们构成酶的辅酶 co enzyme 或辅基 prostheticgroup 与酶蛋白共同组成全酶 holoenzyme 脱去辅基的酶蛋白不含有催化活性 称为脱辅基酶蛋白 apoenzyme 有时又称为酶原 proenzyme zymogen 辅酶与酶蛋白松弛结合 可以通过透析法除去 辅酶A辅基与酶蛋白牢固结合 金属离子铁卟啉 亚铁血红素 heme 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NADH 四 酶的活性中心 activecenter 酶的特殊催化能力只局限在它的大分子的一定区域 这个区域就是酶的活性中心 它往往位于分子表面的凹穴中 活性中心的各基团与附近的其他残基有序的排列 使得这个部位的空间结构恰好适合与底物分子直接紧密接触 并具有适宜的非极性微环境 以利于基团间发生静电作用 一般认为活性中心有两个功能部分 结合域 bindingdomain 参与同底物结合 决定酶促反应的专一性催化域 catalyticdomain 直接进行催化 决定酶的催化效率 五 邻近 效应 定向 效应 邻近 Vicinity 效应指两个反应分子的反应基团需要互相靠近才能反应 但是 仅仅 邻近 还不够 还需要两个将要反应的基团分子轨道交叉 而交叉的方向性极强 称为 定向 orientation 这样就使得两个分子间的反应变为分子内的反应 提高了反应速率 生物体系中的许多反应属于双分子反应 在酶的作用下 原游离存在的反应物分子被结合在活性中心 彼此靠得很近 并且分子轨道也按确定的方向发生一定的偏转 使得反应易于进行 有人估计 邻近 效应及 定向 效应可能使反应速度增长上亿倍 六 诱导契合假说活性中心通常为一个口袋或裂缝 由周围的氨基酸链帮助结合底物 而其他的氨基酸直接参与催化反应 1894年 德国生物化学家E Fishcher提出 锁 钥假说 lock and keyhypothesis 即酶与其特异性底物在空间结构上互为琐 钥关系 1958年 D Koshland提出诱导契合假说 inducedfithypothesis 底物 酶 酶 底物复合物 底物 酶 底物变形 酶分子变形 七 酶催化的化学形式酶催化的化学形式主要包括共价催化和酸碱催化 在共价催化中 酶与底物形成反应活性很高的共价中间物 这个中间物很易变成过渡态 transitionstate 故反应的活化能大大降低 底物可以越过较低的能阈而形成产物 酸碱催化广义的指质子供体及质子受体的催化 酶反应中的酸碱催化十分重要 发生在细胞内的许多反应都是受酸碱催化的 酶蛋白中可以起酸碱催化作用的功能团有氨基 羧基 巯基 酚羟基及咪唑基等 2 2 3酶促反应的米氏动力学底物浓度对酶促反应速度的影响比较复杂 将反应初速度 对底物浓度 S 作图 1 底物浓度低时 反应速度随底物浓度的增加呈线性增长 表现为一级反应 2 随着底物浓度的增加 反应速度增高趋缓 表现为混合反应 3 再继续加大底物浓度 反应速度趋向一个极限 近似零级反应 说明酶已被饱和 这是酶促反应特有的现象 Michaelis和Menten首先提出酶促反应中存在着酶 底物中间复合物 并将酶促反应过程表示为 E SESE P 2 7 从这一理论出发 根据化学平衡原理 推导出表示底物与反应浓度与反应速度之间的关系方程式 这就是米氏方程 Michaelisequation 式中 Vm为最大反应速度 KM为米氏常数 Michaelisconstant 根据规定 米氏常数是 2 7 中三个解离常数的复合函数 KM k1 k2 Kcat Vm S KM S 米氏常数在数值上等于酶促反应速度达到最大速度一半 1 2VM 时的底物浓度 单位为mol L或mg L 是酶的重要特征常数 它可以通过将米氏方程变换成双倒数方程实验求得 对于KM 还可以作如下分析 1 一定条件下 酶的KM是常数 对不同来源的酶 比较其KM 可确定哪些酶是同种酶 哪些酶是同工酶 催化作用相同 但性质或构造不同的酶 2 KM受pH与温度等环境因素的影响 在不同环境条件下求出KM 可探索环境对KM乃至对酶活性的影响 3 如果酶作用底物有几种 则最小KM 也有用最小Vm KM比值 表示底物与酶的最适底物或天然底物 4 从酶的KM可粗略估计细胞内底物浓度变动范围 一般来说 底物浓度不会比KM高出太多 5 从KM与米氏方程式 可以求出达到规定反应速度的适当的底物浓度 或已知底物浓度下相应的反应速度 理论上 若是达到最大反应速度 底物浓度至少要20KM 图2 5酶动力学温态期反应物质浓度变化 稳态假说TheSteady StateAssumption 催化常数Kcat catalyticconstant 是酶动力学的第二个重要常数 用来直接描述酶分子活力 在最适合的底物浓度下 每摩尔酶每分钟将底物浓度转变为产物的底物的摩尔数 或有关基因的当量数 Kcat越大 在酶分子表面的催化事件发生越快 即催化效率高 Kcat的单位是s 1 因此 Kcat的倒数可以被看作是时间 s 即一个酶分子转换一个底物分子所需要的时间 故Kcat有时被称为转化数 turnovernumber 影响酶促反应的因素影响酶促反应的因素很多 除了酶和底物的性质 还有酶的抑制剂 温度 pH值 酶的活性和底物浓度等 1 抑制剂永久性 不可逆 不可逆抑制剂的结合位点通常与底物的结合位点不同 它是通过分解酶与底物的复合物来抑制反应物的生成 因此这种抑制不能通过加过量的底物来消除 可用化学方法除去抑制剂 使酶复活 暂时性 可逆 是抑制剂和酶很快达成平衡 由于酶和抑制剂的结合是可逆的 所以可逆抑制剂可以被大浓度的正常底物所取代 2 温度温度主要影响酶的稳定性 它导致酶的构象变化而影响酶和底物的结合 而降低酶促反应的最大反应速度 通常在4 下保存 3 pHpH对酶促反应的影响 使酶的空间结构破坏 引起酶的失活 影响酶活性部位催化基团的解离状态 使底物不能分解为产物 影响酶活性部位结合基团的解离状态 使其不能与底物结合 影响底物的解离状态 使底物不能和酶结合 或结合后不能生成产物 2 3微生物反应2 3 1微生物反应的特点微生物反应过程是利用微生物进行生物化学反应的过程 就是将微生物作为生物催化剂进行的反应 酶在微生物反应中起最基本的催化作用 微生物反应与酶促反应的共同点 1 同属生化反应 都在温和条件下进行 2 凡是酶可以催化的反应 微生物也可以催化 3 催化速度接近 反应动力学模式近似 微生物反应的特殊性 1 微生物细胞的膜系统为酶反应提供了天然的适宜环境 细胞可以在相当长的时间内保持一定的催化活性 2 在多底物反应时 微生物显然比单纯酶更适宜作催化剂 3 细胞本身能提供酶促反应所需要的各种辅助因子和能量 4 微生物细胞比酶的来源更方便 更便宜 微生物作为传感器分子识别元件时不利因素 1 微生物反应通常伴随细胞的生长和调亡 不易建立分析标准 2 细胞是多酶系统 许多代谢途径并存 难以排除不必要的反应 3 环境变化会引起微生物生理状态的复杂化 不适当的操作会导致代谢转换现象 出现不期望有的反应 2 3 2微生物反应类型1 同化与异化 根据微生物代谢流向 同化作用 assimilation 或组成代谢 细胞将底物摄入并通过一系列生化反映转变成自身的组成物质 并储存能量 异化作用 disassimilation 或分解代谢 细胞将自身的组成物质分解以释放能量或排出体外 2 自养与异养 根据微生物对营养的要求 自养 autotrophic 自养微生物的CO2作为主要碳源 无机氮化物作为氮源 通过细菌的光合作用或化能合成作用获得能量 异样 heterotrophic 异养微生物以有机物做碳源 无机物或有机物作氮源 通过氧化有机物获得能量 绝大多数微生物种类都属于异养型 3 好气性与厌气性 根据微生物反应对氧的需求与否 好氧 aerobic 性微生物 在有空气的环境中才易生长繁殖的微生物 厌氧 anaerobic 性微生物 必须在无分子氧的环境中生长繁殖的微生物 4 细胞能量的产生与转移微生物反应所产生的能量大部分转移为高能化合物 高能化合物是指含转移势高的基团的化合物 其中以ATP最为重要 它不仅潜能高 而且是生物体能量转移的关键物质 直接参与各种代谢反应的能量转移 有两类反应可以产生ATP 2 3 3分析微生物学分析微生物学 analyticalmicrobiology 是利用微生物完成定量分析任务的学科 有些情况下 微生物测定法比化学方法更专一和灵敏 效率亦更高 细胞增殖和呼吸法最常用 b 2 4免疫学反应免疫指机体对病原生物感染的抵抗能力 自然免疫是非特异性的 即能抵抗多种病原微生物的损害 获得性免疫是特异性的 在微生物等抗原物质刺激后才形成 免疫球蛋白等 并能与该抗原起特异性反应 2 4 1抗原1 抗原的定义 抗原 antigen 是能够刺激动物机体产生免疫反应的物质 但从广义的生物学观点看 凡是具有引起免疫反应性能的物质 都可称为抗原 抗原有两种性能 刺激机体产生免疫应答反应免疫原性 immunogenicity 完全抗原 completeantigen Ag 与相应免疫反应产物发生特异性结合反应反应原性 reactionogenicity 半抗原 hapten 2 抗原的种类按抗原物质的来源 抗原分为三类 1 天然抗原 2 人工抗原 3 合成抗原3 抗原的理化性质 1 物理性状分子质量对免疫原性的影响 分子质量越大抗原性越强 原因在于复杂的大分子物质表面抗原决定族较多 化学性质相对稳定 在体内存留时间长 降解和排除速率较慢 有利于持续刺激肌体免疫系统 产生免疫应答 抗原构型对免疫原性的影响 环壮构型 直线构型聚合态分子 单体分子 2 化学组成绝大多数为蛋白质 可为纯蛋白质 也可为结合蛋白质 4 抗原决定簇 antigendeterminant 抗原决定簇是抗原分子表面的特殊化学基团 抗原的特异性取决于抗原决定簇的性质 数目和空间排列 4 2抗体抗体 antibody 是由抗原刺激机体产生的具有特异性免疫功能的球蛋白 又称免疫球蛋白 immunoglobulin Ig 人类免疫球蛋白有五类 即IgG IgM IgA IgD和IgE 图 免疫球蛋白 Ig 结构模式图 重链 heavychain H链 分子质量较大 420 460个氨基酸组成轻链 lightchain L链 分子质量较小 213 216个氨基酸组成 2 4 3抗原 抗体反应抗原抗体的相互作用是所有免疫化学技术的基础 它们之间的反应是指抗原与抗体之间发生的特异性结合反应 这种反应可发生于体内 invivo 也可发生在体外 invitro 体内反应可介导吞噬 溶菌 杀菌 中和毒素等作用 体外反应则根据抗原的物质性状 抗体的类型及反应的特点而分为凝聚 沉淀 溶解反应等不同的类型 抗体与抗原的特异性结合点位于FabL链及H链的高变区 抗体活性中心 其构型取决于抗原决定簇的空间位置 两者可形成互补性构型 抗原 抗体结合时准确对位的两个条件 结合部位的形成要互补于抗原的形状抗体活性中心带有与抗原决定簇相反的电荷抗体的特异性是相对的 表现在 部分抗体不完全与抗原决定簇相对应即便是针对某一种半抗原的抗体 其化学结构也可能不一样抗原抗体结合在一定pH或离子强度下也是可逆的 基于抗原 抗体反应的检测技术主要应于以下几个方面 1 用已知抗原检测未知抗体2 用已知抗体检测未知抗原3 定性或定量检测体内各种大分子物质4 用已知抗体检测某些药物 激素等各种半抗原物质影响抗原 抗体结合反应的因素1 抗原抗体的性质 抗原 抗体反应的整体强度受3个因素控制 抗体对表位的内在亲和力 抗原抗体的结合价以及参与反应成分的立体结构 2 电解质 抗原抗体发生特异性结合后 由亲水性胶体变为疏水性胶体 电极质的存在会使抗原 抗体复合物失去电荷而沉淀或凝集 出现可见反应 3 酸碱度 蛋白质具有两性电离的性质 抗原抗体的反应必须在合适的pH环境中进行 4 温度 一般在37 高温抗原抗体变性 低温反应太慢 2 4 4免疫学分析免疫分析是利用抗体与抗原的特异性结合作用来选择性识别和测定可以作为抗体或抗原的待测物 抗原 抗体反应的特异性和专一性决定了免疫反应具有很高的选择性 1 沉淀法可溶性抗体与其相应的抗原在液相中相互接触 可形成不溶性抗原 抗体复合物而发生沉淀 包括扩散实验和电泳试验 此为经典的免疫学实验 灵敏度水平为 g ml 2 放射免疫测定法 radiationimmunoassay RIA 利用放射性同位素示踪技术和免疫化学技术结合起来的方法 灵敏度高 特异性强 准确度高 重复性好 同位素危害 3 免疫荧光测定法 immunofluorescentassay 高度的特异性和敏感性 可定位 serumcarcinoembryonicantigen CEA 4 酶联免疫测定法 enzymelinkedimmunoassay ELISA 用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应 灵敏度不高 但是特异性 重现性和准确性很好 成本低 稳定性好和操作安全等 应用最广 酶免疫分析主要有两种 夹心法和竞争法 夹心法要求抗原至少有两个结合点 不能用于检测半抗原 多用于测定大分子物质 产生的信号强度与结合在固相上的抗原量成比例关系 夹心法测抗原示意图 竞争法产生的信号强度与结合在固相上的酶标抗体量成正比例关系 与样品中的抗原量成反比关系 主要用于测定小分子抗原 竞争法测抗原示意图 5 电化学免疫分析 electrochemistryimmunoassay ECIA 电化学免疫分析是将免疫技术和电化学检测相结合的一种标记免疫分析方法 用作电化学免疫分析的生物酶及反应体系须满足以下条件 酶具有高或性 可在短时间内将大量底物分子转化为产物 产物具有电化学或性 酶底物和酶在缓冲溶液中稳定 酶产物的副反应很少 容易与抗体或抗原结合 且不降低活性 在测定条件下体系底物非活性 2 5核酸与核酸反应2 5 1核酸组成与结构1 核酸的组成成分核酸是所有生命体的遗传信息分子 包括脱氧核糖核酸 DNA deoxyribonucleicacid 和核糖核酸 RNA ribonucleicacid 两类核酸都是由单核苷酸 nucleotide 组成的多聚物 核酸分子中的核苷序列组成密码 其功能是储存和传输遗传信息 指导各类型蛋白质的合成 单核苷酸的组成 碱基 脱氧核糖或是核糖 磷酸基团 腺嘌呤 adenine A 鸟嘌呤 guanine G 胞嘧啶 cytosine C 胸腺嘧啶 thymine T DNA的碱基组成 Chargaff规则的内容 所有DNA A T G C 即A G T C DNA的碱基组成具有种的特异性 即不同种的DNA碱基组成不一样 对同一生物物种 DNA的碱基组成没有组织和器官的特异性 DNA的碱基组成不随年龄 营养状况及环境的改变而改变 Chargaff规则的意义该规则为后来建立DNA双螺旋结构模型奠定的基础 并为阐明DNA的生物学功能提供了重要依据 2 DNA结构一级结构 脱氧核苷酸在长链上的排列顺序二级结构 双螺旋链 碱基配对规则 氢键 最主要的力 维持双螺旋链稳定因素 碱基堆积力 vanderWaals 分子内部碱基对间的疏水键 Watson和Crick于1953年根据DNA晶体的X 射线衍射图谱和Chargaff规则等数据提出双螺旋结构 一级结构 不同构象只是螺距 直径 每圈含碱基数目不同 3 RNA结构RNA在细胞中主要以单链形式存在 可暂时形成双螺旋 或自折叠成双螺旋区域 尿嘧啶 uracil U 2 5 2DNA变性 denature 核酸的紫外吸收特性 DNA在260nm处有最大的紫外吸收值因嘌呤碱和嘧啶碱对250 280nm的光波有强的吸收作用 对260nm光波的吸收能力最大 当核苷酸摩尔数相同时 A260的大小有如下关系 单核苷酸 单链DNA 双链DNA从左到右称为减色效应 hypochromism 从右到左称为增色效应 hyperchromiceffect DNA的双螺旋结构比双螺旋松驰结构对紫外 260nm 的吸收要小 最大可降低约34 因为DNA双螺旋结构中的碱基对彼此之间又形成了碱基堆积力 影响了碱基对260nm光的吸收 当DNA双螺旋松散后 所得的光吸收值几乎是其组成中所有碱基光吸收值的总和 DNA的紫外吸收特性的应用估计核酸样品的纯度一般 A260 A280 1 8 2 0 DNA纯度符合要求A260 A2802 0 提示DNA样品中含有RNA 实质破坏了核酸的空间结构 但不涉及一级结构 共价键 的断裂 引起变性的因素加热 热变性 介质中的pH过低或过高 加入有机溶剂 加入尿素等介质中的pH过酸或过碱对DNA双螺旋结构的影响 过量酸使A G C上的氮原子质子化 不利于氢键形成 过量碱使G T上的氮原子去质子化 亦不利于氢键形成 高温时DNA双链会分离 称为解链 melting 当温度返回常温时 DNA或RNA能够重新回到天然结构 称为复性 annealing 当光吸收强度增加到最大值的一半时 所对应的温度称为解链温度 meltingtemperature Tm 2 5 3核酸分子杂交 定义应用核酸分子的变性和复性的性质 使来源不同的DNA 或RNA 片断按碱基互补关系形成杂交双链分子 这一过程称为核酸的分子杂交 杂交的两条链 一条是待测的单链的核酸分子 如克隆的基因片断 PCR产物 基因组DNA或细胞总RNA等 另一条可以是探针核酸探针是指特定的已知碱基序列的核酸片断 可以是DNA cDNA mRNA及RNA等 在现代分子生物学实验中 探针的制备和使用是与分子杂交相辅相成的技术手段 意义核酸杂交是核酸研究中一项最基本的实验技术 该技术在分子生物学研究领域中被广泛应用 如用于基因组中特定基因序列的定性和定量检测 基因突变分析以及某些遗传性疾病 如地中海贫血 血友病 苯丙酮酸尿症等 的诊断 2 5 4核酸功能一 DNA功能 DNA是遗传信息的载体 其所携带的信息不仅是安全可靠的 还可以读取和利用 并代代稳定相传 DNA通过三个反应实现上述功能 自我复制 selfapplicatio