重组DNA技术基础ppt课件

第二章重组 技术基础 DNA组成与结构 一级结构碱基的排列顺序 二级结构DNA的双螺旋形式 高级结构DNA的超螺旋形式 核酸分子组成 DNA的分子结构 一 核酸的分类 戊糖 构成RNA 1 2 3 4 5 D 呋喃核糖 ribose 构成DNA D 2 脱氧呋喃核糖 deoxyribose 2 碱基 嘌呤 purine 嘧啶 pyrimidine 胞嘧啶 cytosine C 尿嘧啶 uracil U 胸腺嘧啶 thymine T 腺嘌呤 adenine A 鸟嘌呤 guanine G 核苷 AR GR UR CR脱氧核苷 dAR dGR dTR dCR 3 核苷 ribonucleoside 碱基 核糖 脱氧核糖 连接方式 C N糖苷键碱基 9 1位 戊糖 1 位 1 1 核苷酸 AMP GMP UMP CMP脱氧核苷酸 dAMP dGMP dTMP dCMP 核苷酸 ribonucleotide 核苷 脱氧核苷 磷酸磷酸酯键 体内重要的游离核苷酸及其衍生物 AMP cAMP 核苷酸的连接 磷酸二酯键 C G A 二 核酸的一级结构 定义 核酸中核苷酸的排列顺序 碱基序列 书写方法 5 pApCpTpGpCpT OH3 5 ACTGCT3 竖式 横式 简化式 DNA的空间结构 一 DNA的二级结构 一 双螺旋结构 DNA双螺旋结构模型要点 Watson Crick 1953 两条DNA单链分子反向平行环绕 右手螺旋走向 表面大沟与小沟相间 螺旋直径为2nm 主链 戊糖 磷酸骨架位于外侧侧链 碱基对位于内侧碱基平面垂直于螺旋轴碱基距 0 34nm 螺距 3 4nm 周长 10对碱基 碱基形成氢键配对 配对形式为 A T G C 碱基互补配对 T A C G 稳定因素 1 氢键维持横向稳定性 2 碱基堆积力维持纵向稳定性 3 介质中阳离子可以有效地屏蔽磷酸基之间的静电斥力 DNA双螺旋结构的多样性 A型 B型 型 二 与DNA碱基顺序相关的特殊结构 碱基顺序颠倒重复而具有2倍对称的DNA段落 镜像重复序列 tsDNA是在DNA双螺旋结构的基础上形成的 三条链均为同型嘌呤 homopurine Hpu 或同型嘧啶 homopyrimidine Hpy 即整段的碱基均为嘌呤或嘧啶 三 三股螺旋DNA tsDNA 也称H DNA Py Pu Py型 在偏酸性pH中稳定 较多见 Hoogsteen碱基配对 四 四螺旋DNA G四碱基体结构示意图 四螺旋DNA的生物学意义 真核染色体末端含有一个富含G的单链DNA尾巴 可自身回折形成HoogsteenG G碱基对 两个DNA分子 染色体 可彼此连接 形成一个局部四螺旋结构 这种结构起着稳定染色体和在复制过程中保持其完整性的作用 五 酶活性DNA 1995年Cuenoud等发现了具有酶活性的DNA 再次丰富了酶学 Cuenoud根据共有序列设计并合成了由47个核苷酸组成的单链DNA E47 以此连接两个底物DNA S1和S2 二 DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装 一 DNA的超螺旋结构 超螺旋结构 superhelix或supercoil DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构 正超螺旋 positivesupercoil 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同 负超螺旋 negativesupercoil 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反 意义DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用 二 原核生物DNA的高级结构 三 DNA在真核生物细胞核内的组装 真核生物染色体由DNA和蛋白质构成 其基本单位是核小体 nucleosome DNA 约200bp组蛋白 H1 H2A H2B H3 H4 核小体的化学组成 RNA的结构 StructureofRNA RNA的种类 分布 功能 mRNArRNAtRNA 一 mRNA的结构与功能 内含子 intron 外显子 exon 真核细胞mRNA结构特点 5 末端有甲基化鸟苷帽子结构 m7GpppNm 2 3 末端有多聚腺苷酸尾巴 PolyA 帽子结构 促进mRNA由胞核向胞质的转位维持mRNA的稳定性翻译起始的调控 帽子结构和多聚A尾的功能 mRNA的功能把DNA的碱基序列翻译成蛋白质的氨基酸顺序 tRNA的一级结构特点含10 20 稀有碱基 如DHU3 末端为 CCA OH5 末端大多数为G具有T C 二 转运RNA的结构与功能 N N 二甲基鸟嘌呤 N6 异戊烯腺嘌呤 双氢尿嘧啶 DHU 4 巯尿嘧啶 稀有碱基 tRNA的二级结构 三叶草形氨基酸臂DHU环反密码环额外环T C环 氨基酸臂 额外环 tRNA的三级结构 倒L形 tRNA的功能活化 搬运氨基酸到核糖体 参与蛋白质的翻译 rRNA的结构 三 rRNA的结构与功能 rRNA的功能参与组成核蛋白体 作为蛋白质生物合成的场所 rRNA的种类 真核生物5SrRNA28SrRNA5 8SrRNA18SrRNA 原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA S 沉降系数 单位时间内的沉降速度 核酸的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid 1 核酸的溶解度核酸是极性分子 微溶于水 不溶于乙醇或异丙醇 DNA 蛋白质 脱氧核糖核蛋白 DNP 在1mol L的NaCl溶液中的溶解度最大 RNA 蛋白质 核糖核蛋白 RNP 在0 14mol L的NaCl溶液中的溶解度最大 一 核酸的一般理化性质 核酸属于两性电解质 但因为磷酸的酸性较强 因此总体呈现较强的酸性 具有较低的等电点 当溶液的pH 4时 呈多负离子状态 容易与金属离子结合形成盐 2 酸碱性 3 核酸的高分子性质粘度 DNA RNAdsDNA ssDNA4 核酸的紫外吸收 OD260 单核苷酸 ssDNA 或RNA dsDNA 5 核酸的化学性质核酸中的嘌呤和嘧啶能进行脱氨 聚合 烷基化等反应等 脱氨 C U 脱氨 C U A T C G A A T T G C A T U G A A T T A C 千万年后 G C将不复存在 聚合紫外光诱导两个相邻嘧啶之间形成二聚体 二 DNA的变性 denaturation 定义 在某些理化因素作用下 DNA双链解开成两条单链的过程 方法 过量酸 碱 加热 变性试剂如尿素 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇 丙酮等 变性后其它理化性质变化 OD260增高粘度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 例 变性引起紫外吸收值的改变 DNA的紫外吸收光谱 增色效应 DNA变性时其溶液OD260增高的现象 热变性 解链曲线 如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260 absorbance A A260代表溶液在260nm处的吸光率 值作图 所得的曲线称为解链曲线 Tm DNA变性时紫外光吸收值达到最大值的50 时的温度称为DNA的解链温度 又称融解温度 meltingtemperature Tm 影响Tm的因素 1 G C含量 G C越高 Tm越高2 DNA样品均一性 均一的DNA样品 Tm范围较狭窄 3 核酸的种类 双链RNA RNA DNA杂交链 DNA双链4 溶液的离子强度 离子强度高 Tm值高 三 DNA的复性与分子杂交 DNA复性 renaturation 的定义在适当条件下 变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象 这一现象称为复性 减色效应DNA复性时 其溶液OD260降低的现象 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性 这一过程称为退火 annealing 不同来源的核酸链分子复性时形成杂化双链过程叫分子杂交 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成 也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成 这种现象称为核酸分子杂交 核酸分子杂交 hybridization DNA DNA杂交双链分子 不同来源的DNA分子 核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置确定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础 核酸酶核酸酶是指所有可以水解核酸的酶 核酸酶的分类依据底物不同分类DNA酶 deoxyribonuclease DNase 专一降解DNA RNA酶 ribonuclease RNase 专一降解RNA 依据切割部位不同核酸内切酶 分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶 核酸外切酶 5 3 或3 5 核酸外切酶 参与DNA的合成与修复 RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程负责清除多余的 结构和功能异常的核酸 同时也可以清除侵入细胞的外源